B7-H3 – et viktig protein i utviklingen av kreft

Christina Tekle
Institutt for kreftforskning, Radiumhospitalet, Oslo universitetssykehus og Det medisinske fakultet, Universitetet i Oslo (UiO)
E-post: christina.tekle@rr-research.no

BAKGRUNN OG HENSIKT
Så mange som 90 % av alle kreftpasienter dør på grunn av at kreften har spredd seg til andre organer enn der den opprinnelig oppstod. Denne prosessen kalles meta­stase. I tillegg er metastasene/dattersvulstene mer resistene mot systemisk ­terapi enn modersvulsten. For å påvise kreftspredning tidlig og kunne behandle pasientene best mulig, må man ha kunnskap om spredningsprosessen og resistensutvikling, og om de molekyler som er involvert. Et ledd i dette arbeidet er å detektere og karakterisere tumorceller som har spredd seg, men som ikke kan påvises ved vanlige diagnostiske metoder, såkalte mikrometastaser. Denne doktorgraden har sitt utspring i mikrometastaseforskning ved Tumorbiologisk avdeling ved Radium­hospitalet under ledelse av professor Fodstad, der man har brukt antistoffer koblet til paramagnetiske kuler for å trekke ut mikrometastatiske celler fra blod, ­benmarg og lymfeknuter ved hjelp av en magnet (1). Det monoklonale antistoffet 376.96 har blitt brukt mye i denne sam­menheng og er spesielt nyttig da det ­bindes til tumorceller fra de fleste kreftformer og i svært liten grad til normal­celler. Vi har påvist at det humane proteinet B7-H3 er det tumor-assosierte antigenet som 376.96 bindes til, og analyser av en rekke kreftcellelinjer viste at B7-H3 var høyt uttrykt på celleoverflaten (2).

B7-H3 er et overflatemolekyl kjent for å ha immunregulatoriske egenskaper. Pro­teinet tilhører B7-familien som består av totalt sju immunregulatoriske ligander som har stimulerende og/eller inhibitoriske signaler ved T-celleaktivering. Reseptoren for B7-H3 er fremdeles ukjent, men eksperimentelle forsøk har demonstrert at ­proteinet har både immunstimulerende og hemmende effekter/funksjoner (3).

Ved flere kreftformer har man sett at det er en sammenheng mellom høyt uttrykk av B7-H3 og avansert sykdom og dårlig prognose, og dette har blitt tilskrevet den immunregulatoriske funksjonen til B7-H3 (4). Med tanke på at proteinet er høyt uttrykt på overflaten av ulike typer kreftformer, var hensikten med avhandlingen å studere om B7-H3 har en mer direkte rolle i kreftceller, uavhengig av den kjente immun­ologiske funksjonen, og spesielt ville vi se om proteinet er involvert i meta­stase og resistens mot cytostatika, to ­vesentlige prosesser i kreftbiologi.

MATERIALE OG METODER
Hovedmetoder i de tre forskningsarbeidene: Humane kreftcellekulturer, dyreforsøk og molekylære, biokjemiske- og celle­biologiske assays. Immunohistokjemi ble brukt for å se på uttrykket av B7-H3-­proteinet i et begrenset antall pasient­prøver for å undersøke relevansen av å studere B7-H3 i en klinisk sammenheng. Celle­linjer etablert fra pasienter med brystkreft og melanom ble studert på molekylært og funksjonelt nivå. For å nærmere forstå funksjonen til B7-H3 ­manipulerte vi disse cellene slik at de ikke lenger uttrykte ­proteinet, noe som ble gjort ved å introdusere en short hairpin RNA (shRNA) ­sekvens som binder seg til B7-H3 og hindrer ekspresjonen. Dette tillot oss å sammenlikne fenotypiske trekk hos celler som hadde uttrykk av B7-H3 med celler som manglet dette proteinet, inklusive effekten av kjemoterapi og cellenes ­invasjons- og migrasjonsevne. For å belyse de underliggende mekanismer for B7-H3s effekter ble det gjort flere molekylære studier av kreftcellene på gen- og proteinnivå for å identifisere involverte molekyler og signalveier. Videre ble ­cellevariantene injisert i immundefekte mus for å undersøke terapirespons samt studere cellenes metastase-potensial.

RESULTATER
Ved å midlertidig hemme uttrykket av B7-H3-proteinet i melanom og brystkreft-cellelinjer, så vi en sterk nedgang i cellenes evne til å migrere og invadere gjennom matrigel. Begge disse parametrene er indirekte mål på cellenes metastase-assosierte egenskaper og våre resultater viser dermed at lavt uttrykk av B7-H3 kan føre til redusert metastaseutvikling. For å følge opp disse resultatene, ville vi også inkludere en in vivo-eksperimentell ­meta­stasemodell i immundefekte mus og rotter.

Stabil hemming av B7-H3-uttrykk ­resulterte i nedsatt metastatisk kapasitet og signifikant økning i symptomfri overlevelse av dyrene, se figur 1. Parallelt var det også en mindre andel av mus i gruppen med nedregulert B7-H3 som hadde ­mikro­skopisk detekterbare metastaser sammenliknet med kontrollgruppen. I tillegg var uttrykket av flere metastase-assosierte ­proteiner funnet å være regulert av B7-H3, se figur 2. Celler med lavt B7-H3-uttrykk viste redusert sekresjon av interleukin-8 (IL-8), redusert ekspresjon av metallo­proteinase-2 (MMP-2) og redusert ­fosforylering av transkripsjonsfaktoren Stat3, som ofte har forhøyet nivå ved kreft. Moduleringen av disse molekylene kan forklare den minskede metastatiske ­aktiviteten i disse cellene.

Siden metastase er nært knyttet til ­kjemoresistens, fokuserte vi våre videre studier på den mulige funksjonen til B7-H3 i respons av metastatiske brystkreftceller på paclitaxel, et kjemoterapeutikum ofte brukt ved brystkreft. Stabil hemming av B7-H3-uttrykk førte til økt paclitaxel-­sensitivitet, mens overuttrykk av proteinet i de samme cellene gjorde dem mer ­resi­stente. Den sensitiviserende effekten var assosiert med økt paclitaxel-indusert apoptose ­(programmert celledød). For å forstå mer av de molekylære mekanismene bak, bestemte vi oss for å undersøke Jak2/Stat3 signalveien som nettopp er kjent for å være involvert i ­kjemoresistens ved brystkreft, og vi fant at aktiviteten eller nivået av ­fosforylering av Stat3 var redusert i kreftcellene der B7-H3-uttrykket var slått ned. Samtidig så vi at uttrykket av de anti-apoptotiske molekylene Mcl-1 og Survivin var minsket i disse cellene, noe som gjør at cellene i større grad kan ­undergå apoptose, se figur 3. Videre viste eksperimenter i immundefekte mus at behandling med paclitaxel førte til signifi­kant anti-tumoreffekt i mus med svulster som ikke uttrykte B7-H3 sammen­liknet med kun en marginal effekt i vektor ­kontrollgruppen. Samlet viser våre data at uttrykket av B7-H3 er av relevans ved brystkreft og at proteinet kan være ­involvert i paclitaxel-­resistens via regu­lering av Jak2/Stat3 signalveien.

DISKUSJON
For å kunne designe ny og mer ­effektiv behandling av kreft, må man ha innsikt i underliggende meka­nismer for meta­stasering og kjemo­resistens. Forskningen i denne avhandlingen viser en ny funksjon av B7-H3 som kan få betydning for ­kreftpasienter. De fleste studier der uttryk­ket av B7-H3 har blitt vurdert ved hjelp av immunohistokjemi i materiale fra kreftpasienter, konkluderer at høyt B7-H3-uttrykk er assosiert med avansert sykdom og/eller dårlig prognose og at disse negative effektene kan relaterestil en immunhemmende effekt av proteinet. Vi har imidlertid, i systemer med lite eller ingen immunologiske faktorer til stede, observert at B7-H3 er involvert i to essensielle maligne prosesser hos tumorcellene, nemlig metastase og kjemoresistens. 

Våre funn viser en ny funksjon av B7-H3 i tillegg til dets kjente immunregulatoriske egenskaper og at hemming av proteinet gir en fenotype som er mindre metastatisk og mer sensitiv for kjemoterapi. Dette indikerer at målrettet terapi mot B7-H3 kan være en aktuell strategi, og i denne sammenhengen har vi identifisert flere molekyler og signalveier som er påvirket av B7-H3-proteinet. Et svært aktuelt tema i moderne kreftterapi er utviklingen av småmolekylære forbindelser som kan hemme signalveier som er dys­regulert ved kreft, og et fremtidig håp er at det kan bli mulig å inhibere uttrykket av B7-H3 med slike hemmere.

KONKLUSJON
B7-H3 er et immunregulatorisk protein, kjent for å ha både stimulatorisk og inhibitorisk effekt på aktiveringen av T-celler. Vi har kartlagt en ny funksjon av dette proteinet som ikke er relatert til dets rolle i immunregulering, og vi har vist at proteinet er høyt uttrykt ved ulike kreftformer, noe som er assosiert med økt metastastisk potensiale og utvikling av resistens mot kjemoterapi. Således kan inhibisjon av B7-H3-uttrykk være er en lovende strategi for å hemme meta­stasering, som er årsaken til de fleste kreftrelaterte dødsfall, og også å øke effekten av konvensjonell kjemoterapeutisk behandling.

Referanser

1. Flatmark K, Bjornland K, Johannessen HO et al. Immunomagnetic detection of micrometastatic cells in bone marrow of colorectal cancer patients. Clin Cancer Res 2002; 8: 444–9.
2. Chen YW, Tekle C, Fodstad O. The immunoregulatory protein human B7H3 is a tumor-associated antigen that regulates tumor cell migration and invasion. Current cancer drug targets 2008; 8: 404–13.
3. Nygren MK, Tekle C, Ingebrigtsen VA et al. B7-H3 and its relevance in cancer; immunological and non-immunological perspectives. Frontiers in bioscience (Elite edition) 2011; 3: 989–93.
4. Loos M, Hedderich DM, Friess H et al. B7-h3 and its role in antitumor immunity. Clinical & developmental immunology 2010; 2010: 683875.
   
   (Publisert i NFT nr. 2/2012 side 28–29.)