Intracellulære signalveier via protein kinase A — Betydning av ulike katalytiske subenheter

Ane Funderud
Cand.pharm.
E-post: ane.funderud@rr-research.no

HENSIKT
Ulike intracellulære signalveier forteller en celle hvordan den skal reagere når den for eksempel stimuleres via en reseptor på overflaten. Syklisk AMP-PKA signalveien er en klassisk signalvei som blant annet ­aktiveres når adrenalin binder β-adrenerge reseptorer (figur 1). Dette fører til ­aktivering av enzymet adenylat syclase inne i cellen, og dannelse av cAMP (figur 2). Syklisk AMP aktiverer videre ulike proteiner, hvorav det best kjente er protein kinase A (PKA). Protein kinaser kan sette fosfatgrupper på andre proteiner, og ved dette regulere deres funksjoner og ­egenskaper. Dette er en svært viktig ­mekanisme for regulering av proteiner, noe som gjenspeiles i at protein kinaser utgjør to prosent av alle genene våre. PKA var den første protein kinasen som ble oppdaget i 1968 (1). PKA påvirker et utall forskjellige prosesser, som celledeling og differensiering, insulinrespons, hjerte­funksjon, immunfunksjon og reproduksjon, for å nevne noen (2).

Figur 1. Viktige komponenter i cAMP-PKA signalveien.

Figur 2. Syklisk AMP (3´,5´-cyclic adenosine monophosphate).

Et viktig spørsmål er hvordan spesifikke signaler dannes når den samme signalveien brukes til å formidle så mange forskjellige effekter. Svaret ligger delvis i at signalveier er svært komplekse systemer, som reguleres på mange nivåer. PKA er for eksempel ikke ett protein, men bygd opp av fire subenheter, to regulatoriske subenheter (R subenheter) og to katalytiske subenheter (C subenheter), som begge ­finnes i flere utgaver, eller isoformer (figur 3).

Figur 3. PKA og isoformer av de regulatoriske (R) og katalytiske (C) subenhetene. Fire gener koder for R subenheter, mens to ulike gener koder for tilsammen 16 ulike C subenheter på grunn av alternativ bruk av eksoner.

C subenhetene frigjøres fra R sub­enhetene når disse binder cAMP. Betydningen av at flere ulike C subenheter uttrykkes i en og samme celle vet man foreløpig lite om. Hensikten med dette arbeidet var å studere mulige ulike ­funksjoner av C subenhetisoformer. Dette ble gjort i to forskjellig systemer. Immunsystemet ble testet fordi det er kjent at PKA påvirker immunresponser gjennom å regulere aktiviteten av ulike immunceller, inklusive T-celler (3). PKA er også kjent for å regulere nivåene av epidermal vekst­faktorreseptor (EGFR), som som er viktig for å regulere cellevekst (4).

MATERIALE OG METODER
Vi benyttet to ulike genetisk modifiserte mus som mangler genene som koder for hovedisoformene av C subenheter, Cα og Cβ (Cα- og Cβ-knockout-mus). «Knockout»­-mus har hatt stor betydning for å forstå funksjon av mange proteiner. Fjorårets nobelpris i fysiologi og medisin ble gitt til Cappechi, Evans og Smithies for deres arbeid med å utvikle teknologien som gjør det mulig å fjerne spesifikke gener hos mus på denne måten.

Ulike protein- og molekylærbiologiske metoder ble benyttet for å studere disse proteinene, inkludert westernblotting, immunocytokjemi og molekylær kloning. Celler og organer i immunsystemet hos mus ble undersøkt ved hjelp av væskestrømscytometri (flow cytometri) og ­immun­ohistokjemi. Immunfunksjon ble undersøkt etter immunisering av modell­antigenet ovalbumin, som dannelse av spesifikke T-celler og antistoffer i serum. Tilstedeværelse av autoantistoffer, som et mål på autoimmunitet, ble undersøkt ved ANA (antinukleært antistoff)-test. Videre ble siRNA «knockdown» benyttet for å bekrefte effekterav Cα- og Cβ­-gen- ­knockout i mus på EGFR-nivåer.

HOVEDFUNN
Vi fant de samme PKA C subenhetiso­formene i immunvev fra mus som i humane T-celler (5, 6). Funn gjort i musemodellen kan derfor ha overføringsverdi til menneske. Videre så vi at to ulike C ­subenhetisoformer så ut til å kunne sitte på det samme PKA holoenzymet (5).

Undersøkelse av cellepopulasjoner og vev fra immunsystemet til Cα- og Cβ- ­knockout-mus viste et normalt ut­­­viklet immun­system. Videre viste det seg at T-­celler­ fra Cα-knockout-mus, men ikke T-celler fra Cβ-knockout-mus, var hyper­reaktive. Likevel så verken Cα eller Cβ ut til å være essens­ielle for immunfunksjon på ­systemisk nivå. Musene så heller ikke ut til å utvikle autoantistoffer, som er et tegn på autoimmunitet, noe man kunne tenke seg som en mulig konsekvens av å ha hyperreaktive celler (7).

Lever og hjerne fra musene ble videre undersøkt for å studere om Cα og Cβ ­kunne ha ulik rolle i å regulere EGFR-­nivåer. ­­Både Cα- og Cβ-knockout­mus hadde redusert uttrykk av EGFR. Cα og Cβ så derfor ut til å kunne erstatte ­hverandre i denne rollen (8).

TOLKNING
At Cα, men ikke Cβ, var nødvendig for å bremse aktivering av T-celler viser for ­første gang at to ulike PKA C subenhetisoformer i samme celle kan ha ulike funksjoner.

C subenhet regulering av EGFR-nivåer viser at C subenhetisoformer også kan ha overlappende funksjoner. Disse funnene, i tillegg til at ulike C subenhetisoformer kan sitte sammen i ett PKA holoenzym, ­representerer nye aspekter av kompleksitet og dertil muligheter for regulering av PKA signalveien. C subenheter som medierer spesifikke effekter kan tenkes å være mål for spesifikk terapi.

De systemiske immunfunksjonene som ble testet var normale til tross for at ­redusert PKA aktivtet i mus uten Cα ­resulterte i hyperaktive T-celler. Dette kan være et resultat av at immunsystemet er gjenstand for en rekke ulike kompensator­iske mekansimer. Det er også mulig at PKA har en viktigere rolle i andre typer immunresponser enn det som ikke ble testet i disse studiene, som for eksempel ved virusinfeksjoner. Mulighet for å kunne regulere immunsystemets aktivitet, og ­spesielt T-celler, som kan sies å styre resten av immunsystemet, er uansett viktig med tanke på terapi ved tilstander der immunsystemet enten er supprimert, som ved immunsvikt og hiv, eller tilstander der immunsystemet er overaktivert, for ­eksempel ved autoimmunitet.

KONKLUSJON
PKA C subenhetisoformer kan ha både unike og overlappende funksjoner i en celle. Kompleksiteten i PKA signalering bidrar til spesifisitet i mediering av cellulære responser, slik at det riktig signal medieres på riktig sted til riktig tid og med riktig styrke. C subenhetisoformer med ulike funksjoner er potensielle mål for spesifikk terapi.

Referanser

1. Walsh DA, Perkins JP, Krebs EG. An ­adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein kinase from rabbit skeletal muscle. J Biol Chem 1968; 243: 3763-3765.
2. Skålhegg BS, Tasken K.Specificity in the cAMP/PKA signaling pathway. Differential expression, regulation and subcellular ­localization of subunits of PKA. Front Biosci 2000; 5: D678-D693.
3. Skålhegg BS, Landmark BF, Døskeland SO et al. Cyclic AMP-dependent protein kinase type I mediates the inhibitory effects of 3',5'-cyclic adenosine monophosphate on cell ­replication in human T lymphocytes. J Biol Chem 1992; 267: 15707-15714.
4. Salazar G, Gonzalez A. Novel mechanism for regulation of epidermal growth factor receptor endocytosis revealed by protein ­kinase A. Mol Biol Cell 2002; 13: 1677-1693.
5. Ørstavik S, Funderud A, Hafte TT et al. Identification and characterization of novel PKA holoenzymes in human T lymphocytes. FEBS Journal 2005; 272:1559-1567.
6. Funderud A, Henanger HH, Hafte TT et al. Identification, cloning and characterization of a novel 47 kDa murine PKA C subunit ­homologous to human and bovine Cβ2. BMC Biochemistry 2006; 7: 20.
7. Funderud A, Aas-Hanssen K, Wikdahl AK et al. Isoform specific regulation of cellular but not systemic immune reactivity by the catalytic subunits of PKA. Submittert manuskript.
8. Oksvold MP, Funderud A, Kvissel AK et al. Epidermal growth factor receptor levels are reduced in mice with targeted disruption of the protein kinase A subunit. BMC Cell Biol 2008; 9: 16.

(Publisert i nr. 7–8/2008 side 16–17.)