Hvordan kombinere strøm med kunstige væskemembraner for isolering og oppkonsentrering av legemidler fra små prøvevolum?

Tekst: Astrid Gjelstad, cand.pharm., stipendiat ved Seksjon for farmasøytisk kjemi, Farmasøytisk institutt, Universitetet i Oslo

Utvikling av nye, forbedrede prøveopparbeidelsesmetoder i mikroskala har også vært et fokusområde for legemiddelanalysegruppen ved Farmasøytisk institutt, Universitetet i Oslo over lengre tid, og sommeren 2005 ble elektromembranisolasjon (EMI) utviklet og patentert som en ny metode for isolering og oppkonsentrering av legemidler.

Metode
Oppsettet som brukes i trefase-EMI er vist i figur 1. En liten hulfiber med porøse vegger av polypropylen dyppes i et organisk løsningsmiddel for å mette porene i veggen med organisk fase. Dette fører til at det blir dannet en tynn, organisk væskefilm som kan skille to vannfaser fra hverandre. Det innvendige hulrommet i fiberen fylles med vannfase (akseptorfase, 25 µl), og fiberen settes ned i en vandig prøveløsning (donorfase, 150-1000 µl). For å sikre ionisering av de basiske legemidlene er pH i både akseptorfase og donorfase surgjort til pH~2 med HCl. En platinaelektrode plasseres direkte i donorfasen, mens en annen plasseres ned i akseptorfasen inne i hulfiberen. Elektrodene kobles til en spenningskilde, og de ioniserte legemidlene vandrer fra donorfasen, over den organiske membranen og inn i akseptorfasen mot elektroden med motsatt ladning. Ekstraksjonen går i 5 minutter med en spenning på 300 V mens ekstraksjonsenheten vibreres på vibrator. Etter at ekstraksjonen er fullført, trekkes akseptorfasen ut av hulfiberen med en mikrosprøyte og overføres til et CE-apparat (kapillærelektroforese) for analyse.

Figur1. Skisse av ekstraksjonsprosessen i elektromembranisolasjon (EMI).

Resultater
Elektromembranisolasjon (EMI) har vist seg å være en rask ekstraksjonsmetode sammenliknet med liknende, eksisterende metoder. Figur 2 viser ekstraksjonsutbyttet som funksjon av tiden etter ekstraksjon av tre basiske legemidler. Etter 5 minutter har legemidlene nådd maksimalt utbytte, og ytterligere ekstraksjonstid gir liten eller ingen gevinst. Utbyttet etter 5 minutter er dessuten høyt, mellom 75% og 95%. Metoden er derfor meget lovende med tanke på både ekstraksjonshastighet og effektivitet.

Figur 2. Utbytte som funksjon av ekstraksjonstid i EMI.

Ved å variere forholdene i EMI, for eksempel benytte ulike organiske faser, varierende spenning og pH i donorfase og akseptorfase kan man få en svært selektiv metode. Tabell 1 viser en oversikt over variasjoner i sammensetning av organisk fase ved ekstraksjon av fire basiske legemidler (1). Hydralazin og cimetidin er hydrofile baser (høy vannløselighet), mens petidin og metadon er relativt hydrofobe baser (lav vannløselighet). I tilfellet med ren nitrofenyl oktyleter (NPOE), blir de hydrofile basene ikke ekstrahert over elektromembranen, mens de hydrofobe basene ekstraheres effektivt. Ved tilsetting av 10 % di(etylhexyl)fosfat (DEHP) til den organiske membranen transporteres hydralazin og cimetidin over membranen, mens transporten av de hydrofobe basene blir mye mindre effektiv. Tilsetning av 10% tris(etylhexyl)fosfat (TEHP) gir like resultater som med ren NPOE. Dersomde to tilsetningsstoffene kombineres i en membran, får man ekstrahert både hydrofile og hydrofobe baser. Resultatene viser at det er mulig å skreddersy en selektiv membran til en bestemt legemiddelgruppe, men at det også er mulig å lage en kombinasjonsmembran for flere ulike legemiddelgrupper.

Tabell 1. Ulik sammensetning av organisk fase i EMI av basiske legemidler (nd=not detectable).

EMI har også vist seg å være velegnet for ekstraksjon av sure legemidler (2). Forholdene i ekstraksjonen må endres slik at syrene ioniseres i basisk akseptorfase og donorfase, og polariteten på elektrodene snus slik at positiv elektrode i hulfiberen trekker til seg de negativt ladede legemidlene. Ekstraksjon av syrer krever dessuten en annen sammensetning av organisk fase i væskemembranen. Langkjedede alkoholer, som for eksempel oktanol, har vist seg å være velegnet som organisk fase i ekstraksjon av syrer.

Store molekyler i biologiske væsker vil ofte forstyrre en analyseprosess, og det er derfor viktig å ha en god metode for isolering av legemidlene man er interessert i. EMI er en metode som er meget godt egnet til opprensning og isolering av legemidler fra biologiske væsker. Figur 3 viser elektroferrogram (UV-absorbans som funksjon av tid etter kapillærelektroforeseanalyse) etter EMI av plasma og urin, med og uten tilsetning av legemiddel (3). Som det går frem av figuren, får man meget rene elektroferrogram, uten interfererende topper fra den biologiske væsken. Membranen ekskluderer forstyrrende substanser i den biologiske væsken, slik at det kun er basiske legemidler som ekstraheres over membranen. EMI er derfor en meget lovende metode for isolering av legemidler fra biologiske væsker.

Figur 3. Elektroferrogram fra EMI av basiske legemidler i biologiske væsker (1=petidin 2=nortriptylin 3=metadon 4=haloperidol 5=loperamid).

Konklusjon
Dette arbeidet viser at elektromigrasjon av legemidler over en kunstig væskemembran er mulig. Den nye prøveopparbeidelsesmetoden gir høye utbytter i løpet av kort tid i forhold til liknende metoder. Ved å variere kjemien i systemet, for eksempel sammensetning av organisk fase og pH i akseptor- og donorfase, kan man få en meget selektiv ekstraksjon. Metoden er meget godt egnet for opprensning og isolering av legemidler fra biologiske prøver. Dersom forskjellen i volum på donorfasen og akseptorfasen i hulfiberen er tilstrekkelig stor, får man i tillegg en meget effektiv oppkonsentrering av legemidlet. Metoden har dermed et stort potensial i fremtidens analytiske kjemi.

Litteratur

1. Gjelstad, Astrid; Pedersen-Bjergaard, Stig; Rasmussen, Knut Einar. Electrokinetic migration across artificial liquid membranes – Tuning the membrane chemistry to different types of drug substances. Journal of Chromatography A 2006;1124:29–34
2. Balchen, Marte; Gjelstad, Astrid; Rasmussen, Knut Einar; Pedersen-Bjergaard, Stig. Electrokinetic migration of acidic drugs across a supported liquid membrane In Press
3. Pedersen-Bjergaard, Stig; Rasmussen, Knut Einar. Electrokinetic Migration across Artificial Liquid Membranes - New concept for Rapid Sample Preparation of Biological Fluids. Journal of Chromatography A 2006;1109(2):183–190

(Publisert i NFT nr. 1/2007 side 31–32.)