Utvikling og evaluering av gonadotropin frigjøringshormon antagonister som SPECT-radiotracere

Last ned hele artikkelen i PDF-format med figurer her.

 

Bakgrunn og hensikt

Mange legemiddel utviklingsprosjekter med amyloid ß plakk som hovedmål i Alzheimers sykdom har feilet (1). Vi har lett oppstrøms i hormonsystemet etter årsakene til Alzheimers sykdom, og forsøkt å utvikle en måte å synliggjøre gonadotropin-reseptorer med billeddiagnostikk som bringer fagfeltet videre. Vi syntetiserte derfor en rekke GnRH-antagonister for å finne den beste kandidaten for konvensjonell nukleærmedisin (SPECT).

Alzheimers sykdom er den vanligste årsaken til demens (2).  Diagnosen stilles på bakgrunn av klinisk undersøkelse og tilleggsundersøkelser med cerebrospinalvæske (nivå av amyloid ß plakk, total tau-protein og fosforylert tau-protein), MR og PET. Det er mange ulike teorier som forsøker å forklare patofysiologien til Alzheimers sykdom, som eksempel amyloid kaskade hypotesen, tap av kjønnshormoner, og andre forstyrrelsen i neurotransmisjonen (GABA, Kolinerg, Serotonerg). Foreløpig kan ingen forklare årsaken til sykdommen og dannelsen av de toksiske substansene amyloid ß plakk og tau-protein (3).

I dette doktorgradsarbeidet har hypotesen tap av kjønnshormoner blitt undersøkt nærmere siden studier har vist en sammenheng med Alzheimers sykdom (4). Ved å kvantifisere tettheten av GnRH-reseptorer i hjernen kan det hjelpe oss i forståelsen av den komplekse patofysiologien for Alzheimers sykdom og dermed  diagnostisere sykdommen på et tidlig stadium. Som utganspunkt for studien  brukte vi den delen av molekylet WAY207024 som allerede er kjent for å binde til GnRH-reseptoren. WAY207024 er et lite ikke-peptid med god bindingsaffinitet for GnRH-reseptoren (5). Hovedmålet med doktorgradsarbeidet var å undersøke potensialet disse GnRH-antagonistene hadde som radiotracere.

Materiale og metoder

En klassisk metode for utvikling av nye radiotracere ble fulgt, hvor første steg var syntese av et bibliotek av GnRH-antagonister. Disse ble så validert for bindingsaffinitet til GnRH-reseptoren. Neste steg i utviklingen var radiomerking av de mest aktuelle forbindelsene. Det ble brukt kopper-mediert radiojodinering og Finkelstein reaksjon med deltakelse av nærliggende funksjonelle grupper for å radiomerke de ønskede og mest lovende molekylene. For den kopper-medierte radiojodineringen ble reaksjonsbetingelsene undersøkt hvor flere ulike løsningsmidler, ulike koppersalter og additiver ble forsøkt for å finne de beste reaksjonsbetingelsene. Undersøkelsene av Finkelstein reaksjonen i forbindelse med deltakelse av nærliggende funksjonelle grupper ble gjort som et kinetisk eksperiment og reaksjonene ble i tillegg kartlagt ved databeregninger. Dernest ble de utvalgte molekylene evaluert in vitro og in vivo ved serum stabilitet, metabolsk fase I-analyse og autoradiografi i rottehjerner. I tillegg ble ett molekyl evaluert preklinisk med dyreforsøk (rotter) ved biodistribusjon og SPECT-bildeanalyser.

Resultater

Flere av de syntetiserte molekylene viste god bindingsaffinitet (nM affinitet) til GnRH-reseptoren sammenliknet med den allerede kjente WAY207024 forbindelsen. I tillegg viste molekylene økt vannløselighet som er ønskelig for å minske spesifikk binding (figur 1, se PDF) (6). Den kopper-medierte radiojodineringen med radioaktivt ¹²³I ga produkt i 76 % og 12 % radiokjemisk utbytte (RCY) ved henholdsvis radiojodinering på benzimidazolen for forbindelse 3 og på triazoldelen for forbindelse 4 (skjema 1, se PDF). Jodineringen på benzimidazolen er en interessant reaksjon som ble undersøkt videre ved å jodinere flere andre bioaktive molekyler på samme måte (7). Videre utførte vi radiojodinering med radioaktivt ¹²³I ved bruk av Finkelstein reaksjonen der vi ville undersøke bidraget fra den funksjonelle nabogruppen ved bruk av samme molekyl med ulike karbonkjedelengder (skjema 2, se PDF). Vi fikk produkt i 80 % RCY og reaksjonen var ferdig i løpet av 10 minutter for forbindelsen med to karboner i kjedelengde, i tillegg ble reaksjonsmekanismene kartlagt og beskrevet. Ved bruk av mikrobølgeovn var reaksjonene for de øvrige molekylene med lengre karbonkjeder ferdig etter 5 minutter (8). Videre undersøkte vi noen utvalgte forbindelser in vitro og dataene viste god serum stabilitet i rotte og humant serum. Undersøkelsene av fase I-metabolismen viste at de utvalgte molekylene viser god stabilitet for bruk ved SPECT-bildeanalyser. Autoradiografistudien viste selektiv binding til GnRH-reseptorer i rottehjernen. Biodistribusjon og SPECT-bildeanalysene for den ene utvalgte forbindelsen som ble undersøkt videre i rotter viste ingen opptak i hjernen.

Diskusjon

I dette doktorgradsarbeidet ble mange lovende molekyler for radiomerking syntetisert og radiomerket. I tillegg ble noen utvalgte molekyler evaluert in vitro og in vivo med biodistribusjon og konvensjonell nukleærmedisinsk (SPECT) bildeanalyse. Selv om det ikke ble påvist opptak i hjernen for den ene forbindelsen, har dette mest sannsynlig sin årsak i reaktiviteten til det undersøkte molekylet som ikke var egnet som en radiotracer. De andre utvalgte molekylene viste god stabilitet i serum-analysene og god stabilitet i fase I-metabolismen. I tillegg viste de selektiv binding til rottehjernen ved autoradiografi. For videre evaluering er det planlagt prekliniske studier av de mest lovende molekylene.

Konklusjon

Denne klassen av GnRH-antagonister har et stort potensial som radiotracere for å kartlegge tettheten av GnRH-reseptorer i hjernen og dermed kunne brukes som radiotracere for tidligdiagnostikk av Alzheimers sykdom presymptomatisk.

Referanser

1. Mullard A. Alzheimer amyloid hypothesis lives on. Nat Rev Drug Discov 2016; 16: 3–5.
2. Prince PM, Wimo PA, Guerchet DM et al. World Alzheimer report 2015. 2015.
3. Castellani RJ, Rolston RK, Smith MA. Alzheimer Disease. Dis Mon 2010; 56: 484–546.
4. Webber KM, Perry G, Smith MA et al. The Contribution of Luteinizing Hormone to Alzheimer Disease Pathogenesis. Clin Med Res 2007; 5: 177–83.
5. Pelletier JC, Chengalvala MV, Cottom JE et al. Discovery of 6-({4-[2-(4-tert-butylphenyl)-1H-benzimidazol-4-yl]piperazin-1-yl}methyl)quinoxal ine (WAY-207024): an orally active antagonist of the gonadotropin releasing hormone receptor (GnRH-R). J Med Chem 2009; 52: 2148–52.
6. Fjellaksel R, Boomgaren M, Sundset R et al. Small molecule piperazinyl-benzimidazole antagonists of the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor. MedChemComm 2017; 8: 1965–9.
7. Fjellaksel R, Sundset R, Riss PJ et al. Copper-Mediated Late-Stage Iodination and ¹²³I-Labelling of Triazole-benzimidazole Bioactives. Synlett 2018; 29: 1491–5.
8. Fjellaksel R, Dugalic D, Demissie TB et al. An acylation-Finkelstein approach to radioiodination of bioactives: The role of amide group anchimeric assistance. J Phys Org Chem 2018: e3835-n/a.

(Publisert i NFT nr. 7/2018 side 21–23.)