Antibiofilmaktivitet av nye antimikrobielle peptider og liposomal innkapsling som en lovende tilnærming for å forbedre deres effekt

Last ned hele artikkelen i PDF-format med figur her. (788KB)

Bakgrunn og hensikt

Biofilmer er strukturerte mikrobielle samfunn innleiret i en egenprodusert ekstracellulær matriks som kan dannes på både biotiske og abiotiske overflater i menneskekroppen (1). Mikrober i biofilmer har vist å ha økt toleranse mot antimikrobielle midler, noe som bidrar til vedvarende og kroniske infeksjoner (1). I klinisk sammenheng er biofilmdannelse blitt knyttet til ulike typer infeksjoner som kroniske sår, periodontitt, urinveisinfeksjoner og utstyrsrelaterte infeksjoner, som de som involverer katetre og implantater (2). Den beskyttende matriksen og den økte toleransen mot antimikrobielle midler gjør biofilmassosierte infeksjoner spesielt utfordrende å behandle og understreker behovet for forbedrede terapeutiske strategier.

Antimikrobielle peptider (AMP-er) er små, amfifile molekyler, vanligvis bestående av færre enn 100 aminosyrer, med rask og kraftig aktivitet mot et bredt spekter av patogener, inkludert multiresistente bakterier (3). Et fremtredende eksempel er teixobactin, et syklisk depsipeptid som hemmer celleveggsyntesen ved å binde til både lipid II og III (4). Denne doble virkningsmekanismen er antatt å være en barriere for bakterienes resistensutvikling. Et annet eksempel er micrococcin P1 (MP1), et thiopeptide som hemmer proteinsyntesen hos et bredt spekter grampositive bakterier, inkludert meticillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) og vankomycinresistente enterokokker (VRE). (5). Til tross for sitt terapeutiske potensial er farmasøytisk utvikling av AMP-er begrenset på grunn av dårlig peptidstabilitet, følsomhet for proteolytisk nedbrytning og utfordringer med oppskalering av produksjon. Derfor er utvikling av effektive formuleringer og leveringssystemer avgjørende for å konvertere deres terapeutiske potensial om til klinisk bruk.

Liposomer er selvorganiserende fosfolipidbaserte vesikler i nanostørrelse, som kan kapsle inn både hydrofile og hydrofobe forbindelser. På denne måten kan de virke som bærere av legemiddelmolekyler og samtidig beskytte dem mot nedbrytning i kroppen (6). Liposomformuleringer har vist å kunne forbedre legemidlers penetrasjon i biofilmer, øke legemiddelretensjon og muliggjøre målrettet levering gjennom interaksjon med mikrobielle cellemembraner (7). Innføring av såkalte fusogene lipider i liposomsammensetningen kan fremme fusjon med mikrobielle celler, noe som muliggjør direkte levering av høye konsentrasjoner av antimikrobielle midler ved målcellene og dermed øke antimikrobiell effekt (8). Liposombasert levering av AMP-er representerer derfor en lovende strategi for å forbedre både direkte antimikrobiell og antibiofilmaktivitet.

Denne avhandlingen undersøkte potensialet til fusogene liposomer som nanobærere for nye antimikrobielle peptider for å forbedre deres effekt mot biofilmassosierte infeksjoner. Den antimikrobielle og antibiofilmaktiviteten til nye teixobactinanaloger ble også undersøkt med mål om å identifisere de mest lovende kandidatene for videre farmasøytisk utvikling.
 

Materialer og metode

Kolesterolfrie fusogene liposomer ble fremstilt ved tynnfilmhydrering med DOPE som fusjonsfremmende fosfolipid. Liposomer med varierende acylkjedelengder (C16, C18, C20) i hovedlipidet ble lastet med MP1, og karakterisert med hensyn til størrelse, polydispersitetsindeks (PDI), zetapotensial, innkapslingseffektivitet og peptidstabilitet. Fusjon og interaksjon mellom ulike liposomer og mikrobielle celler (C. albicans, S. aureus, E. coli) og forhåndsdannede S. aureus-biofilmer ble evaluert med lipidblandingsanalyse, flowcytometri og konfokal laserskanningsmikroskopi. Antibakteriell og antibiofilm-aktivitet av MP1-liposomer og tre teixobactinanaloger (TB1–TB3) ble vurdert med MIC, MBC, vekstkurver, kolonitelling, krystallfiolett- og metabolsk aktivitetsfarging på 96-brønnsplater og mot biomaterialer (PTFE og PVC). Biokompatibilitet ble testet gjennom hemolyseprøve og cytotoksisitet mot humane dermale fibroblaster.
 

Resultater

Fusogene liposomer var fysisk stabile over en periode på ett år ved 4° C. Inkorporering av fosfolipidet DPPC kompenserte for utelatelsen av kolesterol fra formuleringen og bidro dermed til å opprettholde liposomenes strukturelle integritet. Fusjonsanalyser viste høyest fusjonseffektivitet med den gramnegative bakterien E. coli, etterfulgt av den grampositive bakterien S. aureus og soppen C. albicans. Nøytrale liposomer viste størst fusjonseffektivitet, etterfulgt av de kationiske og anioniske liposomene. Konfokal mikroskopi bekreftet penetrasjon av alle liposomformuleringene inn i S. aureus-biofilmer, der de kationiske liposomene viste økt retensjon i biofilmmatriksen (figur 1A, se PDF). Biokompatibilitetsstudier viste ingen cytotoksiske effekter på humane hudfibroblaster og ingen hemolytisk aktivitet.

Liposomal innkapsling av microccocin P1 (MP1) forbedret både peptidstabilitet og antimikrobiell aktivitet, og senket MIC-verdiene 4 til 16 ganger mot de testede S. aureus-stammene. Liposomer formulert med lengre fosfolipid-acylkjeder (DAPC) økte ytterligere MP1-innkapslingen og antibiofilmaktiviteten, men viste redusert stabilitet etter to ukers oppbevaring i kjøleskap. Ved 0,25 µg/mL reduserte MP1-holdige liposomer levedyktigheten til biofilmceller med 55 % sammenliknet med kun 15 % med fritt MP1.

Teixobactinanalogene viste også sterke antibakterielle og antibiofilm-egenskaper der TB3 fremsto som den mest aktive forbindelsen. Behandling med TB3 reduserte levedyktigheten til S. aureus-biofilm med 65 % og total biovolum med 75 % (figur 1B, se PDF), noe som bekrefter dens potensial som en lovende legemiddelkandidat for videre utvikling.
 

Diskusjon

Disse funnene viser at kolesterolfrie fusogene liposomer kan være effektive nanobærere for antimikrobielle peptider. Den forbedrede interaksjonen av kationiske liposomer med S. aureus-biofilmer kan tilskrives elektrostatisk tiltrekning til den negativt ladede biofilmmatriksen. Fusjonsevnen til liposomene som ble demonstrert samt deres biokompatibilitet, støtter ytterligere liposomenes egnethet for legemiddellevering mot bakterier. Liposomal innkapsling av MP1 forbedret både peptidstabilitet og antibiofilmeffektivitet. Høyere innkapslingseffektivitet av MP1 i fosfolipider med lengre acylkjeder skyldes sannsynligvis sterkere hydrofobe interaksjoner mellom peptidet og lipidbilaget. I tillegg kan den forbedrede antibiofilmaktiviteten forklares med økt membranforstyrrende kapasitet til langkjedede fosfolipider som fremmer destabilisering av biofilmer. Evnen til amfifile molekyler, som fosfolipider, til å forstyrre biofilmintegritet er tidligere rapportert i flere studier (7, 9).

Det naturlige stoffet teixobactin representerer en lovende ny klasse av antimikrobielle midler med høy aktivitet mot grampositive bakterier og samtidig lav tendens til resistensutvikling. Kjemisk syntese av teixobactinanaloger i tilstrekkelig kvantum vil underlette farmasøytisk utvikling og produksjon av stoffet. Resultatene med teixobactinanalogene i denne studien viser at deres terapeutiske potensial var sammenliknbart med modersubstansen. Den overlegne antimikrobielle og antibiofilmaktiviteten til TB3 sammenliknet med de to andre analogene kan skyldes substitusjon med norvalin i posisjon 10 i molekylstrukturen (introduksjon av en lineær tre-karbon sidekjede) – en effekt også rapportert i andre studier av teixobactinanaloger (10). Ytterligere studier av struktur–aktivitetsforhold er imidlertid nødvendig for å avklare mekanismen bak denne observasjonen.
 

Konklusjon

Denne avhandlingen viser at nyere antimikrobielle peptider, som MP1 og TB3, er lovende legemiddelkandidater for behandling av biofilmbaserte infeksjoner. Videre formuleringsarbeid viser også at kolesterolfrie fusogene liposomer kan forbedre leveringen av peptider som MP1 til bakterier og bakterier i biofilmer, samt bidra til bedre peptidstabilitet. Sammensetning av lipider i liposomformuleringen påvirker fusjonsevnen med mikrober og interaksjon med biofilmer, og dermed avgjørende for effektiviteten av leveringssystemet.
 

Referanser

1. Liu HY, Prentice EL, Webber MA. Mechanisms of antimicrobial resistance in biofilms. NPJ Antimicrob Resist 2024; 2: 27.
2. Pinto H, Simões M, Borges A. Prevalence and Impact of Biofilms on Bloodstream and Urinary Tract Infections: A Systematic Review and Meta-Analysis. Antibiotics (Basel) 2021; 10: 825.
3. Somase V, Desai SA, Patel VP et al. Antimicrobial Peptides: Potential Alternative to Antibiotics and Overcoming Limitations for Future Therapeutic Applications. Int J Pept Res Ther 2024; 30: 45.
4. Ling LL, Schneider T, Peoples AJ et al. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. Nature 2015; 517: 455–9.
5. Ongpipattanakul C, Desormeaux EK, DiCaprio A et al. Mechanism of Action of Ribosomally Synthesized and Post-Translationally Modified Peptides. Chem Rev 2022; 122: 14722–814.
6. Sharma VK, Agrawal MK. A historical perspective of liposomes-a bio nanomaterial. Materials Today: Proceedings 2021; 45: 2963–6.
7. Panthi VK, Fairfull-Smith KE, Islam N. Liposomal drug delivery strategies to eradicate bacterial biofilms: Challenges, recent advances, and future perspectives. Int J Pharm 2024; 655: 124046.
8. Pavlov RV, Akimov SA, Dashinimaev EB et al. Boosting Lipofection Efficiency Through Enhanced Membrane Fusion Mechanisms. Int J Mol Sci 2024; 25: 13540.
9. Fang J-Y, Chou W-L, Lin C-F et al. Facile biofilm penetration of cationic liposomes loaded with DNase I/Proteinase K to eradicate Cutibacterium acnes for treating cutaneous and catheter infections. Int J Nanomedicine 2021:16: 8121–38.
10. Jin K, Po KHL, Kong WY et al. Synthesis and antibacterial studies of teixobactin analogues with non-isostere substitution of enduracididine. Bioorg Med Chem 2018; 26: 1062–8.

(Publisert i NFT nr. 3/2026, side 32–33)