Applikasjoner av naturlige dyp-eutektiske løsemidler i grønne antimikrobielle formuleringer

Bakgrunn og hensikt

Løsemidler har en vital rolle i designet av en legemiddelformulering, og kan løse problemer knyttet til lav løselighet, biotilgjengelighet, stabilitet eller effektivitet. Mange virkestoffer som er under utvikling eller kommer på markedet i dag, har lav vannløselighet og lav permeabilitet (1). Organiske løsemidler er fortsatt i utstrakt bruk i farmasøytisk industri, som alternativer til vann, til tross for at mange av dem er toksiske og lite miljøvennlige. Et viktig steg mot en mer bærekraftig industri er å bytte ut skadelige løsemidler med grønne alternativer (2). Naturlige dyp-eutektiske løsemidler (NADES) er en gruppe væsker som har fått stor oppmerksomhet for deres bærekraftige egenskaper. NADES er biologisk nedbrytbare, fornybare og antas å være lite toksiske både for mennesker, dyr og miljø. De er basert på naturlige stoffer som finnes i levende organismer, og er billige og enkle å produsere. I de siste årene har det vært økende interesse for bruk av NADES i antimikrobielle farmasøytiske produkter ettersom de kan ha antimikrobiell aktivitet og har gode solubiliseringsegenskaper (3).

Hensikten med doktorgradsarbeidet var å undersøke egenskapene til NADES som farmasøytiske hjelpestoffer og evaluere potensialet i bærekraftige, antimikrobielle formuleringer. Både NADES med sur pH og nøytral pH ble studert, men med hovedvekt på nøytrale NADES. Ulike cellemembranmodeller (liposomer og grisehud) og in vitro cellestudier ble benyttet for å vurdere deres egnethet i farmasøytiske formuleringer. De antimikrobielle studiene fokuserte i hovedsak på antibiofilmeffekter av NADES. Det ble utviklet en bærekraftig filmformulering for applikasjon i antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT).

Materiale og metoder

Ulike NADES ble produsert ved å løse komponentene (tabell 1) i vann, og dampe av vannet ved bruk av rotavapor. Væskenes fysikalsk-kjemiske egenskaper ble karakterisert, og det ble undersøkt hvordan de påvirket liposomer og grisehud, blant annet med hensyn til fysisk stabilitet, overflateladning (zeta-potensial), permeabilitet og hudstruktur (FT-IR). NADES med nøytral pH ble testet for mulige antibiofilm-effekter in vitro. Væskenes evne til å fjerne biofilm, hindre dannelse av biofilm og effekt på bakteriell viabilitet ble studert for Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa. Celleviabilitetsstudier ble gjennomført for nøytrale NADES på hudceller.

Ulike filmformuleringer ble produsert inneholdende NADES og et kollagenhydrolysat utvunnet av biprodukter fra kyllingindustri. Et porfyrin ble lastet inn i filmen som fotosensitiser i aPDT-behandling. Produktets mekaniske egenskaper, stabilitet, cytokompatibilitet med hudceller og dets fototoksisitet mot modellbakterier ble undersøkt.

 

Resultater

De fysikalsk-kjemiske egenskapene (blant annet pH, osmolalitet og viskositet) til de undersøkte NADES varierte avhengig av hvilke komponenter de bestod av og vanninnholdet i væsken (4). Undersøkelser av interaksjoner mellom NADES og liposom-modellmembranene viste i de fleste tilfeller god fysisk stabilitet av liposomene, selv om det ble observert noen endringer i størrelse, overflateladning og membranpermeabilitet (4). En mulig administrasjonsvei for preparater med NADES er dermalt. Derfor ble det undersøkt hvordan permeabiliteten gjennom grisehud for et modell-antibiotikum ble påvirket ved påføring av NADES på huden i forkant. Hovedfunnene var at permeabiliteten ble noe redusert ved NADES-applikasjon (4). Det ble funnet få endringer i grisehudens struktur etter kontakt med nøytrale NADES, men hydrogenbindinger mellom sure NADES og hudstrukturer ble observert. Celleviabilitetsstudiene med hudceller viste at viabiliteten varierte betydelig i de ulike NADES, hvor de kolinkloridbaserte NADES utviste høyest cytotoksisitet.

Antibiofilm-aktiviteten til nøytrale NADES ble studert in vitro ved å se på gjenværende biofilmmasse og bakterienes viabilitet etter behandling, og om de hindret biofilmdannelse (5). NADES ChG og ChX, som begge inneholder kolinklorid, utviste sterke baktericide egenskaper mot bakteriene som oppholdt seg i biofilmen, med opptil 99,9999 % reduksjon i levende bakterier. Samtlige testede NADES fjernet moderate mengder med biofilmmasse, men var ikke i stand til eradikere den fullstendig. Biofilmdannelse var hemmet selv ved eksponering til lave konsentrasjoner av NADES. Dette skyldtes mest sannsynlig at NADES begrenset de planktoniske bakterienes vekst, som ble observert i vekstkurve-studier.

En film med ChX (10 % v/v), porfyrin og kollagen-hydrolysat (10 % w/v) ble den mest vellykkede formuleringen med hensyn til NADES-ens evne til å optimalisere filmens mekaniske egenskaper og å løse porfyrin. Tilførsel av NADES i kollagenfilmen økte filmens fleksibilitet betydelig uten å redusere den fysiske stabiliteten. Filmformuleringen desintegrerte hurtig i vann (< 5 min) og utviste høy cytokompatibilitet med hudceller. Den bakterielle fototoksisitetsstudien viste at formuleringen hadde høy aktivitet mot den grampositive modellbakterien, men var på den annen side ikke effektiv mot den gramnegative modellstammen.
 

Diskusjon

De store variasjonene i fysikalsk-kjemiske egenskaper og formuleringsegenskaper mellom NADES-ene som ble undersøkt, viste at det var mulig å tilpasse NADES til bestemte bruksområder i en formulering ved utvelgelse av komponenter og justering av vanninnhold. Funnene fra modellmembranstudiene og studien på grisehud samlet tydet på at NADES i de fleste tilfeller var lovende som farmasøytiske hjelpestoffer. På den annen side nyanserte celleviabilitetsstudiene denne konklusjonen, ettersom det var klare tegn til cytotoksisitet for de kolinkloridbaserte NADES. Interessant nok var det de samme NADES (ChX og ChG) som viste høy cytotoksisitet, som også hadde høyest antibakteriell aktivitet i biofilmstudien. Det er tidligere funnet at ammonium kationer (som kolin) kan akkumulere i det lipide dobbeltlaget og slik forårsake toksisitet, som kan være en årsak til resultatene for ChX og ChG i bakterie- og cellestudiene (6). Den moderate reduksjonen i biofilm etter NADES-behandling viste at NADES-ene testet i dette arbeidet ikke utviste biofilm-eradikerende egenskaper, og det er uklart hva mekanismen bak antibiofilm-effektene er. En tidligere studie rapporterer at enkelte NADES kan løse opp biomakromolekyler som er viktige for biofilmstrukturen, men det kunne ikke konkluderes med om dette var tilfellet i vår studie (7). Filmformuleringen viste at NADES spilte flere viktige roller: Den virket som et plastiserende middel ved å øke fleksibiliteten til filmen og gjøre den mindre sprø. I tillegg var NADES viktig for å øke løseligheten til porfyrinet, som har svært lav vannløselighet. På den annen side var formuleringen suboptimal med hensyn til blant annet lav fototoksikologisk effektivitet mot gramnegative bakterier og en for hurtig desintegrasjonshastighet som kan begrense bruksområdet for formuleringen.
 

Konklusjon

Dette doktorgradsarbeidet har gitt økt innsikt i mulighetene for bruk av NADES i fremtidige bærekraftige antimikrobielle farmasøytiske produkter. Kort oppsummert innehar NADES lovende egenskaper som farmasøytiske hjelpestoffer, blant annet ved å være plastiserende og solubiliserende, men det krever grundig screening av blant annet komponenter og vanninnhold for tilpasning til ønsket bruksområde. Videre forskning på cytotoksisitet in vitro og toleranse in vivo er også nødvendig for å kartlegge potensialet for disse grønne løsemidlene.
 

Referanser

1. Kalepu S, Nekkanti V. Insoluble drug delivery strategies: review of recent advances and business prospects. Acta Pharm Sin B 2015; 5: 442–53.
2. González-Campos JB, Pérez-Nava A, Valle-Sánchez M et al. Deep eutectic solvents applications aligned to 2030 United Nations Agenda for Sustainable Development. Chem Eng Process 2024; 199: 109751.
3. Zainal-Abidin MH, Hayyan M, Ngoh GK et al. Emerging frontiers of deep eutectic solvents in drug discovery and drug delivery systems. J Control Release 2019; 316: 168–95.
4. Nystedt HL, Grønlien KG, Tønnesen HH. Interactions of natural deep eutectic solvents (NADES) with artificial and natural membranes. J Mol Liq 2021; 328: 115452.
5. Nystedt HL, Grønlien KG, Rolfsnes RR et al. Neutral natural deep eutectic solvents as anti-biofilm agents. Biofilm 2023; 5: 100114.
6. Gal N, Malferarri D, Kolusheva S et al. Membrane interactions of ionic liquids: possible determinants for biological activity and toxicity. Biochim Biophys Acta 2012; 1818: 2967–74.
7. Nava-Ocampo MF, Al Fuhaid L, Verpoorte R et al. Natural deep eutectic solvents as biofilm structural breakers. Water Res 2021; 201: 117323.
    

(Publisert i NFT nr. 8/2025, side 40–41)