Syntese av spesialiserte pro-oppløsende mediatorer og analoger

 
Last ned hele artikkelen i PDF-format med figurer her. (224KB)
 

Bakgrunn og hensikt

Akutt inflammasjon er en respons utløst av vevsskade eller invasjon av patogener (1). Den inflammatoriske responsen er avgjørende for å bekjempe det inntrengende patogenet og for videre vevsreparasjon. Når faren er over, går inflammasjonen tilbake, og kroppen returnerer til homeostase. Dette omtales som oppløsningsfasen. Manglende oppløsning av inflammasjon kan føre til kronisk inflammasjon, som igjen kan føre til alvorlige inflammatoriske sykdommer (2). Oppløsningsfasen er en aktiv prosess der endogent dannede spesialiserte pro-oppløsende mediatorer (SPM-er) spiller en sentral rolle. SPM-er er oksygenerte flerumettede fettsyrer (PUFA-er), biosyntetisert fra omega-6 PUFA-en arakidonsyre (AA) og omega-3 PUFA-ene eikosapentaensyre (EPA), dokosaheksaensyre (DHA) og n-3 dokosapentaensyre (n-3 DPA) (figur 1, se PDF).

SPM-er er potente agonister for G-proteinkoblede reseptorer (GPCR-er), hvor aktivering fører til antiinflammatoriske og pro-oppløsende effekter, inkludert reduksjon av inflammatorisk og nevropatisk smerte (3). I dag er flere individuelle klasser av SPM-er kjent, som lipoksiner,  resolviner, maresiner, protektiner og n-3 DPA-seriene av resolviner, maresiner og protektiner.

SPM-er, som dannes endogent under ulike inflammatoriske tilstander, er ikke-toksiske og godt tolerert uten immunsuppressive bivirkninger (4). Dette gjør SPM-er til attraktive kandidater for utvikling av nye legemidler mot kronisk inflammasjon. SPM-er produseres i svært små mengder i kroppen, noe som vanskeliggjør strukturoppklaring av forbindelsene. Derfor er stereoselektiv totalsyntese av SPM-er nødvendig for å kunne sammenlikne den kjemiske strukturen av endogent materiale mot syntetisert materiale. I tillegg vil utvidede biologiske studier av SPM-er bli mulig med syntetisert materiale tilgengelig.

SPM-er er utsatt for rask lokal enzymatisk metabolisme til mindre aktive produkter (5). Av den grunn kan mindre strukturelle modifikasjoner av SPM-er forlenge tiden før enzymatisk inaktivering. Det er derfor ønskelig å utvikle mer kjemisk og metabolsk stabile analoger, som innehar de samme gunstige biologiske effektene som SPM-er.
 

Materialer og metoder

SPM-en resolvin D5_{n-3 DPA} (RvD5_{n-3 DPA}) ble først rapportert i litteraturen i 2013 etter isolasjon fra biologiske kilder (6). For å syntetisere RvD_{5n-3 DPA} ble strukturen delt opp i tre byggeklosser der to av disse måtte syntetiseres over flere trinn, mens den siste kunne kjøpes direkte fra forhandler. Etter omfattende arbeid i laboratoriet ble syntesen vellykket ved bruk av mange ulike typer kjemiske reaksjoner. Strukturen til målmolekylet ble bekreftet ved hjelp av analysemetoder som kjernemagnetisk resonans (NMR), høyoppløselig massespektrometri (HRMS) og UV-Vis. Renheten av produktet ble avgjort ved bruk av væskekromatografi (HPLC). En analog av RvD5_{n-3 DPA}, kalt 17(R/S)-Me-RvD5_{n-3 DPA}, ble også syntetisert, med en strukturell endring som gjør den mer robust mot enzymatisk inaktivering (figur 2, se PDF). Etter fullført syntese ved Farmasøytisk institutt, Universitetet i Oslo, ble produktene sendt til ulike samarbeidspartnere for videre studier. Matching-studier, reseptorstudier og cellekulturstudier av RvD5_{n-3 DPA} ble utført av Dalli-gruppen ved Queen Mary University of London. Musestudier ble utført av Ji-gruppen ved Duke University i USA.
 

Resultater

SPM-en RvD5_{n-3 DPA} ble syntetisert over 12 steg (lengste lineære sekvensen) med totalt 8 % utbytte. Matching-studier av endogent isolert materiale mot syntetisert materiale bekreftet den antatte stereokjemien til SPM-en. Videre viste reseptorstudier aktivering av GPR101 i nanomolare konsentrasjoner. In vitro-studier av immuncellene makrofager og nøytrofile granulocytter viste signifikant økning av fagocytose under infeksjon forårsaket av Escherichia coli, Staphylococcus aureus eller zymosan A partikler der RvD5_{n-3 DPA} ble tilsatt, sammenliknet med kontrollforsøk (7).

Analogen 17(R/S)-Me-RvD5_{n-3 DPA} ble syntetisert med et totalt utbytte på 1,2 % over 13 steg (lengste lineære sekvensen). De to syntetiserte produktene, sammen med SPM-en RvD5 ble undersøkt for smertelindrende effekt hos mus med benbrudd. Alle tre molekyler viste god smertelindring hos hannmus, vist i figur 3 B–D (se PDF). Da studien ble utført på samme måte hos hunnmus, viste ingen av molekylene smertelindrende effekt, til vår store overraskelse (figur 3, F–H, se PDF) (8).
 

Diskusjon

Den kjemiske strukturen til SPM-en RvD5_{n-3 DPA} ble bekreftet, i tillegg til potent aktivering av reseptoren GPR101. Dette er verdifull informasjon, da molekylmodelleringsstudier av reseptor-ligand-komplekser er tilgjengelig med dagens teknologi. Dette muliggjør rasjonell design av enklere, mer stabile molekyler som teoretisk passer inn i reseptoren. Basert på beregningsstudier av reseptor-ligand-komplekser ble det syntetisert seks ulike molekyler som er under biologiske undersøkelser per dags dato. Resultatene fra disse studiene er avgjørende for den videre utviklingen av mulige legemidler mot kronisk inflammasjon.

I musestudiene ble det observert kjønnsdiskriminerende resultater. Årsaken til dette er fortsatt ukjent. Det kreves videre forskning for å avdekke hva denne ulikheten skyldes.
 

Konklusjon

Den første totalsyntesen av SPM-en RvD5_{n-3 DPA} ble utført, og matching-studier bekreftet den kjemiske strukturen til naturstoffet. Det ble bevist aktivitet mot GPR101, samt potent pro-oppløsende effekter ved inflammasjon. Analogen 17(R/S)-Me-RvD5_{n-3 DPA} ble syntetisert, og disse molekylene sammen med RvD5 viste kjønnsdiskriminerende smertelindrende effekter hos mus. Disse resultatene er interessante for videre forskning innen feltet, der målet er å utvikle nye legemidler mot kronisk inflammasjon.
 

Referanser

1. Serhan CN, Petasis NA. Resolvins and Protectins in Inflammation Resolution. Chem Rev 2011; 111: 5922–43.
2. Perretti M, Dalli J. Resolution Pharmacology: Focus on Pro-Resolving Annexin A1 and Lipid Mediators for Therapeutic Innovation in Inflammation. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2023; 63: 449–69.
3. Park J, Langmead CJ, Riddy DM. New Advances in Targeting the Resolution of Inflammation: Implications for Specialized Pro-Resolving Mediator GPCR Drug Discovery. ACS Pharmacol Transl Sci 2020; 3: 88–106.
4. Schottelius AJ, Giesen C, Asadullah K et al. An Aspirin-Triggered Lipoxin A4 Stable Analog Displays a Unique Topical Anti-Inflammatory Profile. J Immunol 2002; 169: 7063–70.
5. Serhan CN, Maddox JF, Petasis NA et al. Design of Lipoxin A4 Stable Analogs That Block Transmigration and Adhesion of Human Neutrophils. Biochem 1995; 34: 14609–15.
6. Dalli J, Colas RA, Serhan CN. Correction: Corrigendum: Novel n-3 Immunoresolvents: Structures and Actions. Sci Rep 2014; 4: 6726.
7. Ervik K, Reinertsen AF, Koenis DS et al. Stereoselective Synthesis, Pro-resolution, and Anti-inflammatory Actions of RvD5n-3 DPA. J Nat Prod 2023; 86: 2546–53.
8. Ervik K, Li Y, Ji R-R et al. Synthesis of the methyl ester of 17 (R/S)-Me-RvD5n-3 DPA and relief of postoperative pain in male mice. Org Biomol Chem 2024; 22: 9266–70.

(Publisert i NFT nr. 6/2025, side 32–33)