Fotokjemisk internalisering av EGFR-rettede legemidler

Anette Weyergang 
Avdeling for strålingsbiologi, Institutt for kreftforskning,
Det Norske Radiumhospital

BAKGRUNN OG HENSIKT
Et stort problem med medikamentell anti-cancerbehandling i dag er manglende selektivitet av legemidlene som benyttes. Legemidlene utøver en cytotoksisk effekt i normalt vev i tillegg til målcellene og dette fører ofte til behandlingsbegrensende bivirkninger. Vi trenger derfor nye strategier for å øke selektiviteten av legemidler mot kreft. Økt spesifisitet overfor kreftceller kan oppnås ved å koble legemiddelet til en målsøkende komponent, f.eks. et antistoff eller en ligand, som spesifikt gjenkjenner cancercellene. Slike målsøkende legemidler blir imidlertid ofte store og får derfor problemer med å passere cellens plasmamembran.

Hensikten med oppgaven var å vurdere fotokjemisk internalisering (PCI) av epidermal vekstfaktor (EGFR)-rettede toksiner som en metode for selektiv levering av legemidler til EGFR-positive kreftceller. Toksinet som ble benyttet, saporin, er et type 1 ribosom inaktiverende proteintoksin. Saporin skiller seg fra det mer kjente type 2 toksinet Ricin i det at saporin mangler en cellebindene kjede og translokeres også dårligere til cytosol. Saporin er derfor langt mindre toksisk enn Ricin på hele celler, mens toksisiteten til de to toksinene er relativt lik når begge er translokert til cytosol. I studiene ble det benyttet et affinitetstoksin (EGF-saporin) og et immunotoksin (C225-saporin) rettet mot epidermal vekst faktor reseptor (EGFR) og disse målrettede toksinene ble videre levert til kreftceller ved hjelp av fotokjemisk internalisering (PCI), en strategi for intracellulær levering av legemidler til tumorer (figur 1).

Figur 1. PCI av et immunotoksin mot EGFR. Immunotoksinet administreres sammen med en fotosensitizer (PS) og begge stoffene akkumulerer i cellens endocytiske vesikler. Eksponering av synlig lys fører til aktivering av fotosensitizeren som videre forårsaker skade på endosommembranen slik at toksinet, som er fanget på innsiden, kan slippe ut i cytosol. Toksinet binder seg til ribosomet der det hemmer proteinsyntese og forårsaker celledød.

MATERIALE OG METODER
Studiene er utført in vitro på celler i kultur. Flere EGFR-positive og -negative kreftcellelinjer er benyttet for å demonstrere selektiviteten av behandlingen. Den fotokjemiske reaksjonen ble generert ved hjelp av fotosensitiseren TPPS2a som akkumulerer i cellens endocytiske vesikler og synlig lys fra en lampe. Cytotoksisitet ble målt ved hjelp av viabilitetsassayet MTT, klonogen overlevelse samt celletelling med Counter Coulter. SDS-PAGE, Western blotting og immunoblotting ble gjennomført for å studere hvordan behandlingen påvirket intracellulære signaleringsveier. Intracellulær lokalisering av legemidlene ble studert ved hjelp av fluorescence mikroskopi.

Resultater

• PCI ble vist å øke effekten av affinitets- toksinet EGF-saporin opptil 1000 ganger i EGFR-positive celler (1).
• Cetuximab, et klinisk benyttet mono- klonalt antistoff mot EGFR ble også bundet til saporin, og PCI ble vist å forsterke effekten av immunotoksinet betraktelig (2).
• Den fotodynamiske reaksjonen ble vist å skade EGFR (3), men fotodynamisk skade på EGFR ble vist å være en lite egnet indikator for behandlings- potensialet i kombinasjon med EGFR- rettede legemidler (4,5).
• Den fotodynamiske reaksjonen ble rapportert å aktivere de tre MAPKne: ERK, JNK og p38, og disse signalveiene ble vist å være viktige i celledrap mediert gjennom både fotodynamisk terapi(PDT), PCI og EGFR-rettede lege- midler (6).
• Antistoff og tyrosinkinase-inhibitorer mot EGFR ble rapportert å ha motsatt effekt på overlevelse i kombinasjon med PDT (5).

DISKUSJON
PCI av EGFR-rettede legemidler er en behandlingsmetode som gir spesifisitet overfor kreftceller på tre forskjellige måter. (i) Utnyttelse av et antistoff mot EGFR som blokkerer overlevelsessignalveier i kreftceller, (ii) En fotokjemisk cytotoksisk reaksjon som grunnet lys-administrasjonen blir selektiv i tumoren, (ii) Intracellulær levering av et toksin ved hjelp av PCI (2). Studier av proteinsignaleringen avdekket, imidlertid, mulige interaksjoner mellom legemiddelet rettet mot EGFR og den fotokjemiske reaksjonen. Metoden må optimaliseres med hensyn til legemiddelet rettet mot EGFR, men også med hensyn til behandlingsprotokollen.

KONKLUSJON
EGFR er et godt egnet målmolekyl for legemidler som skal leveres ved hjelp av PCI. PCI av EGFR-rettede legemidler representerer en behandlingsmetode med høy selektivitet overfor EGFR-positive kreftceller.

Referanser

1. Weyergang A, Selbo PK, Berg K. Photochemically stimulated drug delivery increases the cytotoxicity and specificity of EGF-saporin, J. Control Release., 111 (2006) 165–173.
2. Yip WL, Weyergang A, Berg K et al. Targeted delivery and enhanced cytotoxicity of cetuximab-saporin by photochemical internalization in EGFR-positive cancer cells, Mol. Pharm., 4 (2007) 241–251.
3. Weyergang A, Selbo PK, Berg K. Y1068 phosphorylation is the most sensitive target of disulfonated tetraphenylporphyrin-based photodynamic therapy on epidermal growth factor receptor, Biochem. Pharmacol., 74 (2007) 226–235.
4. Weyergang A. Photochemical internalization of gelonin in cancer treatment; Importance of Epidermal growth factor targeted cellular uptake of gelonin upon treatment effect. 1–115. 1–10–2003. School of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Oslo. 2001. Ref Type: Thesis/Dissertation
5. Weyergang A, Berg K. Photodynamic therapy in combination with Tyrphostin AG1478 and Cetuximab act distinctly on EGFR and downstream signalling causing opposite cytotoxic responses, Submitted, (2008).
6. Weyergang A, Kaalhus O, Berg K. Photodynamic therapy with an endocytically located photosensitizer cause a rapid activation of the mitogen-activated protein kinases extracellular signal-regulated kinase, p38 and c-Jun NH2 terminal kinase with opposing effects on cell survival, Mol. Cancer Ther, 7 (2008) 1740–1750.

(Publisert i NFT nr. 10/2009 side 18–19.)