Endocytose og intracellulær transport av FGF1 og FGF-reseptorene

Ellen Margrethe Haugsten 
Biokjemisk avdeling, Institutt for kreftforskning, Det norske Radiumhospital og Det medi­sinske fakultet, Universitetet i Oslo
E-post: e.m.haugsten@medisin.uio.no

HENSIKT
Hensikten med denne oppgaven har vært å sammenlikne opptak og transport i ­celler av FGF1 bundet til hver av de fire forskjellige FGF-reseptorene og videre hvilke konsekvenser disse prosessene har for FGF-signalering.

BAKGRUNN
Vekstfaktorer er signalmolekyler som ­binder til spesifikke sensorer eller resep­torer på celleoverflaten. Idet vekstfaktoren binder til reseptoren sendes et signal inn i cellen. Avhengig av sammenhengen kan slike signaler resultere i at cellen deler seg, beveger seg eller dør. Siden disse signalene er kritiske for en celles videre skjebne, er det viktig at signalene er nøye regulert og skrues av og på til riktig tid. Når slik signalering er ute av kontroll kan kreft og andre alvorlige sykdommer oppstå.

Fibroblast growth factor 1, FGF1, er en vekstfaktor som skilles ut av en rekke ­forskjellige celler og som binder til og ­aktiverer FGF-reseptorerer, FGFR. I ­mennesker finnes fire forskjellige FGFR kalt FGFR1-4. Reseptorene er transmembrane. De består av en del som stikker ut av cellen og en del som stikker inn i ­cytosol. FGF1 binder til den delen av reseptoren som stikker ut av cellen og dette fører til aktivering av et tyrosine kinase domene i den delen av reseptoren som er inne i cellen. Aktivering av reseptorenes tyrosine kinase domene fører til aktivering av en rekke signaleringsproteiner og ­signalveier inne i cellen. Tre viktige ­signalveier som aktiveres av FGFR er MAPK, PI3K/AKT og PLCγ/PKC. FGFR-signalering er involvert i mange fysiolog­iske prosesser under utvikling som i organdannelse, men også i voksne organismer ved å opprettholde homeostase og i ­reparasjon av vev og i dannelse av nye blodårer. Siden signalering fra FGF1 ­spiller en viktig rolle i mange fysiologiske prosesser er det viktig at den reguleres nøyaktig. Økt FGF-signalering kan bidra til utvikling av diverse kreftformer, blant annet prostatakreft, brystkreft og lungekreft. Andre alvorlige sykdommer som skyldes feil i regulering av FGF-signalering er blant annet dvergvekst (både chondro­dysplasia og craniosynostosis syndromer), kallmann syndrom og autosomal dominant hypofosfatemisk rakitt.

Figur 1. Endocytose og intracellulær transport av FGFR. ERC, resirkulerings-endosom, MVB, multivesikulært endosom.

Celler kan regulere signalering fra vekstfaktorer og reseptorer via en prosess kalt endocytose (se figur 1). Endocytose skjer ved at cellens overflate danner en innbuktning hvor vekstfaktoren og den aktiverte reseptoren fanges. Etter hvert avsnøres innbuktningen slik at det dannes en blære (vesikkel) som inneholder det endocyterte materialet. Vesikkelen kan deretter føre det endocyterte materiale til forskjellige destinasjoner inne i cellen. De fleste vekstfaktorer og reseptorer blir ­vanligvis først transportert til sorterings­endosomene. Derfra kan de bli sortert til degradering i lysosomer via multivesikulære endosomer og sene endosomer eller de kan resirkuleres enten direkte eller via resirkuleringsendosomene tilbake til celleoverflaten. Signaleringen fra de aktive reseptorene reguleres avhengig av hvor i cellen de transporteres. Sendes resep­torene til degradering i lysosomer vil ­signaleringen bli skrudd av mens resept­orer som resirkulerer kan fortsette å ­signalere.

Endocytose og intracellulær transport er nøye regulerte prosesser. Clathrin-mediert endocytose hvor blant annet proteinet ­clathrin rekrutteres til membranen og enzymet dynamin avsnører den innbuktede membranen er denbest karakteriserte endocytoseveien. Konjugering av ubiquitin til reseptorer har vært foreslått å fungere som en merkelapp som dirigerer resep­torer til endocytose og til degradering i lysosomer. Ubiquitin er et lite protein som bindes kovalent til aminosyren lysin i proteiner i cytosol og er vanligvis forbundet med merking av proteiner som skal de­graderes i proteasomer.

MATERIALE OG METODER
Arbeidet i avhandlingen er basert på eksperimenter med celler i kultur. Celler som uttrykte ønsket FGFR-konstrukt ble generert ved transient eller stabil trans­feksjon av plasmid DNA. Standard bio­kjemiske teknikker som gelelektroforese, western blotting, RNA-interferens, mutagenese og molekylær kloning ble benyttet. En stor del av arbeidet er basert på ­eksperimenter analysert med konfokal ­fluorescens mikroskopi.

RESULTATER
Ved å studere endocytose av FGF1 i celler som uttrykte enten FGFR1, 2, 3 eller 4 fant vi at uavhengig av hvilken reseptor FGF1 var bundet til ble FGF1 og reseptoren først transportert til sorteringsendosomer (1). Fra sorteringsendosomene ble FGF1 i ­celler som uttrykte FGFR1, 2 eller 3 hovedsakelig sortert til lysosomer og degradert, mens FGF1 i celler som uttrykte FGFR4 hovedsakelig ble resirkulert. Sortering til lysosomer i celler som uttrykte FGFR2 eller FGFR3 var noe mindre effektiv enn i celler som uttrykte FGFR1.

Videre undersøkte vi hvorvidt konjugering av ubiquitin til FGFR1 fungerer som et signal for endocytose og transport til lysosomer (2). Vi genererte FGFR1 mutanter som ikke kunne ubiquitineres. Disse ble endocytert like effektivt som vanlig FGFR1, men ble resirkulert i stedet for å bli sortert til lysosomer for degradering. Siden FGFR1-mutantene unngikk degradering var de aktive og signalerte lengre enn ­normal FGFR1. Reseptor ubiquitinering synes derfor å spille en liten rolle i endocytose av FGFR1, men er nødvendig for riktig sortering av FGFR1 og for termi­nering av FGFR1-signalering.

Vi fant også at FGFR3 i motsetning til FGFR1 kan endocyteres uavhengig av clathrin og dynamin (3). Fjerning av clathrin fra cellene ved bruk av RNA-interferensteknikker førte til forlenget signalering fra FGFR1 mens FGFR3-signalering var lite påvirket.

Enkelte molekyler, blant annet FGF1, kan entre cytosol ved å krysse endosom-membranen (translokere, se figur 1). Translokert FGF1 transporteres deretter til kjernen hvor den blir fosforylert. Ved å utnytte det faktum at kun translokert FGF1 blir fosforylert, undersøkte vi de fire FGFRenes evne til å mediere FGF1 translokasjon (4). Studien viste at FGF1 endocytert i celler som uttrykte FGFR1 eller FGFR4 men ikke FGFR2 eller FGFR3 kunne translokere.

DISKUSJON
Til tross for et økende antall artikler som viser at FGF-signalering er involvert i en rekke fysiologiske prosesser og under deregulering også kan bidra til utvikling av enkelte sykdommer som for eksempel kreft, er de molekylære mekanismene som regulerer FGFR-signalering lite studert. Denne avhandlingen viser at signalering fra FGF1 er langvarig eller kortvarig avhengig av hvilken reseptor FGF1 er bundet til og at dette styres av hvor i ­cellen FGF1 og reseptorene transporteres etter endocytose. At signaleringen fra FGF1 via de fire forskjellige reseptorene kan reguleres på denne måten, øker ­variasjonen i FGF1-signalering. Økt ­variasjon i FGF1-signalering kan bidra til at FGF-reseptorene som hovedsakelig aktiverer de samme intracellulære signalveiene kan generere svært forskjellige responser og være involvert i mange ulike fysiologiske prosesser.

Mye av det vi vet om endocytose og intracellulær transport av reseptorer ­kommer fra forskningpå EGFR (Epidermal growth factor reseptor) og blir ofte ­generalisert til å gjelde for alle reseptorer av liknende type. Det er derfor svært viktig å studere flere typer reseptorer for å vite hvorvidt mekanismene kan generaliseres eller ikke. Det er i tillegg uenighet om enkelte aspekter ved endocytosen av EGFR (som for eksempel om ubiquitinering er nødvendig for endocytose eller ikke). Studier av flere typer reseptorer kan bidra til å klare opp i slike uenigheter.

KONKLUSJON
Endocytert FGF1 transporteres til forskjel­lige destinasjoner inne i cellen avhengig av hvilken av de fire FGF-reseptorene den er bundet til. Konjugering av ubiquitin til FGFR1 er nødvendig for korrekt sortering av FGF1/FGFR1 til lysosomer for degradering, men ikke for endocytose. Transport av FGF1 til forskjellige desti­nasjoner inne i cellen bestemmer FGF-­signalering.

Å forstå hvordan signaleringen fra vekstfaktorer og reseptorer blir regulert er viktig for å kunne utvikle medisiner og/eller behandling i sykdomstilfeller der signalering fra den bestemte reseptoren er ute av kontroll.

Referanser

1. Haugsten EM, Sørensen V, Brech A et al. Different intracellular trafficking of FGF1 endocytosed by the four homo­logous FGF receptors. J.Cell Sci. 2005; 118: 3869-81.
2. Haugsten EM, Małecki J, Bjørklund SMS et al. Ubiquitination of FGFR1 is required for its intracellular sorting but not for its endocytosis. Mol.Biol.Cell 2008;19: 3390-403
3. Haugsten EM, Zakrzewska M, Olsnes S et al. Clatrhin- and dynamin-independent endocytosis of FGFR3. In preparation.
4. Sørensen V, Więdłocha A, Haugsten EM et al. Different abilities of the four FGFRs to mediate FGF-1 translocation are linked to differences in the receptor C-­terminal tail. J.Cell Sci. 2006; 119: 4332–41.

(Publisert i NFT nr. 6/2009 side 20–21.)