Sanko Nguyen
Farmasøytisk ­institutt, Universitetet i Oslo (UiO)
E-post: s.h.nguyen@farmasi.uio.no

BAKGRUNN OG HENSIKT
Dentale problemer er blant de aller vanligste helserelaterte problemene i verden og kan redusere livskvaliteten til et menneske betraktelig (1). Et av de hyppigst forekommende dentale problemer er karies (tannråte). Karies karakteriseres som tap av emaljesubstans (demineralisering) på grunn av syrer som dannes når kariogene bakterier metaboliserer sukker fra mat og drikke. Selv om det er registrert en nedgang i forekomsten av karies de to siste tiårene, særlig i industrialiserte land, er karies fremdeles et stort problem innen global tannhelse. Et stadig økende inntak av sukkerholdig mat og drikke kan være en medvirkende årsak.

Tannslitasje er et annet problem. Her er tapet av emaljesubstans, i motsetning til karies, ikke forårsaket av bakterier i munnhulen. Mekanismene bak slitasje kan være av fysisk art der tennene gnisses mot hverandre eller mot andre ­substanser, eller av kjemisk art der syre, f.eks. magesyre eller sure drikker, kan direkte erodere bort tannemaljen. Dagens forebyggende behandling mot både ­karies og slitasjeproblemer har sine begrensninger, og nye metoder for å beskytte tennene mot demineralisering er derfor ønskelig.

Hensikten med dette doktorgradsarbeidet var å utvikle liposomer som kan adsorberes til tannoverflaten og dermed virke som et fysisk beskyttende lag på tann­emaljen (2–6). I spytt finnes det fosfo­proteiner som kan gå sammen til micelle-liknende globuler i størrelseområdet 100–500 nm (7). Disse strukturene adsorberes til tannemaljen og danner et fysisk lag på tennene som kan forhindre slitasje og syreangrep. Liposomer er nanovesikler som kan formuleres med liknende egenskaper som disse globulære strukturene, og kan dermed etterlikne den naturlige beskyttelsesmekanismen som eksisterer i munnhulen (figur 1).


Figur 1. Elektronmikroskopibilder viser at ­liposomer i vandig miljø (a) har svært lik struktur som micelle-liknende protein­globuler i saliva (b). Foto: © UiO/Gro Smistad

MATERIALER OG METODER
Liposomer ble laget etter en standard­ ­tynn-film metode. Ulike typer fosfolipider med tanke på fleksibilitet og overflateladning ble benyttet for å finne egnede formuleringer. Tre ulike typer av polymeren pektin (høymetoksylert (HM), lavmetoksylert (LM) og amidert pektin (AM)) ble brukt til å dekke overflaten av liposomene (5). Totalt ble 32 ulike liposomformuleringer undersøkt. Liposomer ble karakterisert ved zetapotensiale og partikkelstørrelse ved hjelp av dynamisk lysspredning, og testet ut i adsorpsjonsforsøk. Hydroxyapatittpulver (HA, Ca10(PO4)6(OH)2) ble brukt som modellsubstans for tannemalje (3, 6). Deretter ble utvalgte liposomformuleringer adsorbert til human tannemalje fra uttrukne tenner (6). Mengde adsorbert ble bestemt ved hjelp av fluorescens­spektroskopi. For å etterlikne det orale miljø ble saliva fra parotiskjertler brukt som medium i enkelte forsøk (4, 6). Atom­kraftmikroskopering ble benyttet for ­visualisering (4–5).

RESULTATER OG DISKUSJON
Formuleringsarbeid og screening
Partikkelstørrelsen til udekkede liposomer var i området 90–180 nm, mens for de pektindekkede 220–600 nm. Positivt ­ladede liposomer adsorberte signifikant bedre til HA enn negativt ladede liposomer, trolig på grunn av elektrostatiske interaksjoner. HA så vel som emalje ­uttryk­ker både fosfat- og kalsiumioner på ­overflaten og har dermed amfotære egenskaper. Ved nøytral pH dominerer de negativefosfationene på overflaten (ca. 90 %), og dette kan være forklaringen på hvorfor positive liposomer ble sterkere ­tiltrukket til HA enn negative liposomer. En stabilitetsstudie av liposomene viste at formuleringer med hovedlipidet dipal­mi­toylfosfatidylkolin (DPPC) var mest stabil med tanke på partikkelstørrelse og zetapotensiale (3).

Figur 2

​Figur 2. Skjematisk tegning av den dominerende polygalakturonsyre-kjeden i pektinstrukturen. Røde ringer indikerer eventuelle plasseringer av metoksy- og/eller amid grupper i galakturonsyre-enhetene.

Liposomer ble forsøkt overflatemodifisert med biopolymeren pektin som er negativt ladet ved nøytral pH. Pektin er et polysakkarid med bioadhesive egenskaper. Ulik grad av esterifisering eller amidering av galakturonsyre-enheten til pektinmolekylet gir opphav til ulike typer pektin med påfølgende ulike egenskaper (figur 2). LM- (35 % esterifiseringsgrad), HM- (70 % esterifiseringsgrad) og AM-pektin ble benyttet for å dekke liposomene. Dekking ble verifisert for positive liposomer ved et skifte i zetapotensiale fra positiv til negativ verdi, og en økning i partikkelstørrelse på ca. 120–320 nm etter dekking med pektin. Varierende resultater med de negative liposomene tydet på ufullstendig eller ingen dekking, sannsynligvis på grunn av frastøtningskrefter. Data fra lysspredningsanalysene viste at prøver av de pektindekkede liposomene var relativt monodisperse, noe som tyder på at pektin faktisk ble dekket på enkelliposomene og at det var fravær av store aggregater (5). Alle tre typer pektindekkede liposomer adsorberte til HA, og ingen signifikant forskjell mellom dem ble funnet (6). Liposomer dekket med LM- og HM-pektin ble utvalgt til videre forsøk.

Interaksjonsstudie med saliva
Saliva (spytt) er det dominerende miljøet i munnhulen. Saliva består av 99 % vann, og resterende andel fordeles mellom organiske (proteiner, lipider og karbohydrater) og uorganiske (ioner som fosfat, kalsium og hydrogenkarbonat) forbindelser. For at liposomer skal kunne brukes i munnhulen, var det viktig å undersøke om liposomene interagerer med komponenter i saliva. Turbidimetriske undersøkelser av blandingen parotis saliva-positive liposomer, viste seg å være turbide med faseseparasjon etter 30 minutter (4). Forklaringen ligger sannsynligvis i en elektrostatisk interaksjon mellom positive ­liposomer og de negativt ladede proteinmi­cellene i parotis saliva. Interaksjonen førte til dannelsen av aggregater som ble så store og tunge at de sedimenterte. Basert på disse resultatene er positive liposomer lite egnet for bruk i munnhulen. For blandingen parotis saliva-negative liposomer ble fasese­parasjon derimot ikke observert, og initiell turbiditet var avhengig av ­hvilken type negative liposomer som var i prøven. Negative liposomer med dipal­mitoyl ­fosfatidinsyre (DPPA), og LM- og HM-pektin­dekkede liposomer viste seg å være minst reaktiv med komponenter i saliva.

Bioadhesjon
Fire ulike liposomformuleringer (positive liposomer, negative liposomer, og LM-og HM-pektindekkede liposomer) ble valgt ut for å teste adsorpsjon og retensjon mot human tannemalje. Som forventet ­adsorberte positive liposomer signifikant bedre til tannemaljen enn liposomer med negativ overflateladning. Blant liposomer med negativ overflateladning (pektin­dekkede og negative, udekkede lipo­somer) var det ingen signifikant forskjell i adsorpsjonen. For å undersøke hvor godt liposomene adsorberte tilemaljen, ble de utsatt for en væskestrøm på 2 ml/min etter adsorpsjon. Det viste seg at begge typene pektindekkede liposomer satt bedre på emaljen etter 20 og 60 min enn de udekkede liposomene (6). Dette kan sannsyn­ligvis forklares ved at pektinkjedene ­forårsaker sekundære bindinger som gir bedre retensjon til emaljeoverflaten.

KONKLUSJON
Liposomer adsorberes til human tann­emalje og kan potensielt brukes for fysisk beskyttelse av tenner. Type overflate­ladning på liposomene er en avgjørende faktor for adsorpsjon til HA så vel som til emalje. Positive liposomer interagerer med komponenter i saliva og er derfor ikke så egnet for bruk i munnhulen. De mest ­lovende formuleringer for adsorpsjon til tannemalje er derfor negative liposomer med DPPA, samt LM-og HM-pektin­dekkede liposomer.

Referanser

  1. Petersen PE, Bourgeois D, Ogawa H et al. The global burden of oral diseases and risks to oral health. Bull World Health Organ 2005; 83: 661–669.
  2. Nguyen S. Formulation of liposomes for protective functions for the human dental enamel. Doktoravhandling. Oslo: Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet, Universitetet i Oslo, 2011.
  3. Nguyen S, Solheim L, Bye R et al. The ­influence of liposomal formulation factors on the interactions between liposomes and hydroxyapatite. Colloids Surf B Biointerfaces 2010; 76: 354–361.
  4. Nguyen S, Hiorth M, Rykke M et al. The potential of liposomes as dental drug ­delivery systems. Eur J Pharm Biopharm 2011; 77: 75–83.
  5. Nguyen S, Alund SJ, Hiorth M et al. Studies on pectin coating of liposomes for drug delivery. Colloids Surf B Biointerfaces 2011; 88: 664–673.
  6. Nguyen S, Hiorth M, Rykke M et al. Adhesion of liposomes to the enamel surface. Caries Res (innsendt).
  7. Rykke M, Smistad G, Rölla G et al. Micelle-like structures in human saliva. Colloids Surf B Biointerfaces 1995; 4: 33–44.

(Publisert i NFT nr. 3/2012 side 26–27.)