GluN2B-antagonister og opioideffekter – i rotte og kylling

Bakgrunn og hensikt

I hele sentralnervesystemet uttrykkes en type kalsiumkanaler som heter N-metyl-D-aspartat-reseptorer (NMDA-reseptorer) som er viktige for utvikling av hjernen og dens funksjon. Disse reseptorene er involvert i læring, hukommelse, signaloverføring mellom nerveceller, synaptisk langtidspotensering og langtidsinhibisjon. Endring i reseptorenes distribusjon og sammensetning, og da spesielt subenheten GluN2B, er forbundet med nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons og Alzheimers sykdom. I tillegg er de antatt å være involvert i psykisk sykdom, som schizofreni og klinisk depresjon (1). Videre er NMDA-reseptorer delaktig i utviklingen av opioidtoleranse og avhengighet, et svært aktuelt forskningsfelt med tanke på den pågående opioidkrisen i USA, hvor svært mange mennesker har blitt narkomane (2). På tross av åpenbar nytteverdi, finnes det per i dag ingen GluN2B-spesifikke medisiner eller diagnostiske prober for klinisk bruk. Målet med dette arbeidet var derfor å få mer kunnskap om NMDA-reseptorenes farmakologi, med fokus på GluN2B-spesifikke antagonister. Vi ville også undersøke effekten av prenatal opioideksponering på NMDA-reseptorers funksjon og sammensetning, da metadon er en kjent NMDA-reseptorantagonist, mens buprenorfin og morfin er rene opioid-reseptoragonister (3). Buprenorfin og metadon er mye brukt i legemiddelassistert rehabilitering i Norge.
 

Materiale og metoder

For å validere forhjerne fra kylling som modellsystem for NMDA-reseptorforskning estimerte vi andelen nerveceller i homogenisert forhjernekultur ved hjelp av immuncytokjemisk farging. Deretter ble nivået av GluN2B-subenhet sammenliknet med nivået i prøver fra mus- og rottehjerne, med GluN2B-transfekterte HEK-293-celler som positiv kontroll. Dette ble gjort med western blotting.

Videre brukte vi den validerte nevron-kulturen til å teste effekten av kjente og nye GluN2B-spesifikke antagonister i et ratiometrisk Fura-2-basert assay, der målet var å undersøke evnen til å inhibere NMDA-indusert kalsiuminfluks. I samarbeid med Ingebrigt Syltes gruppe ved Universitetet i Tromsø lagde vi en datamodell av bindingssetet til antagonistene (GluN1/GluN2B aminoterminale domener). Denne modellen brukte vi til å undersøke bindingsegenskapene til de kjente antagonistene in silico, for så å sammenlikne disse med EC₅₀-verdiene vi fikk in vitro.
 

Vi kortidseksponerte kylling in ovo for metadon eller morfin, og langtidseksponerte rotte in utero for metadon eller buprenorfin. Kylllingembryo ble gitt opioid på dag 13 og 14, ved å stikke hull i eggeskallet og injisere stoffene på den chorioallantoiske membranen, før de ble høstet på dag 17 (figur 1). Rottene fikk kontinuerlig tilførsel av opioid via en osmotisk minipumpe, implantert i mor før befruktning. I kylling testet vi GluN2B-nivå i hel cerebellum ved hjelp av western blotting, samt NMDA-reseptorfunksjon i cerebellum ved å stimulere cerebellærkultur med NMDA. Dette ble gjort tre dager etter siste opioidinjeksjon, på dag 17 i egget (fire dager før klekking). I rotte ble nivået av GluN2B i hel cerebellum testet både med western blotting og reseptorbindings-studier på postnatal dag 1, 7, 14 og 21.
 

Resultater

På dag 10 i egget er litt under halvparten av cellene i forhjernekultur fra kyllingembryo modne nevroner, og nivået av GluN2B-subenheter i NMDA-reseptorene er sammenliknbare med nivået i cerebellum hos unge mus og rotter. Aminosyresekvensen til GluN2B-subenhet hos menneske, rotte og kylling er 93 % like, noe som gir et godt grunnlag for ekstrapolering av resultater funnet i kylling, til andre arter. Vi etablerte følgende EC₅₀-verdier for kjente GluN2B-spesifikke antagonister i nevronkultur fra kyllingforhjerne: EVT-101 (EC₅₀ 22 ± 8 nmol/L) > Ro 25-6981 (EC₅₀ 60 ± 30 nmol/L) > ifen-prodil (EC₅₀ 100 ± 40 nmol/L) > eliprodil (EC₅₀ 1300 ± 700 nmol/L). Disse var sammenliknbare med EC₅₀-verdier tidligere etablert i rotte og cellelinjer transfektert med NMDA-reseptorer (4, 5). Bindingssetet til forbindelsen EVT-101 overlapper setet til ifenprodil og Ro 25-6981, og dette ble oppdaget av Stroebel et al. i 2016 (5). Våre in silico-studier forutsa at den relativt ukjente forbindelsen Ro 04-5595 også binder til EVT-101-setet (figur 2). Vi inngikk derfor et samarbeid med Patrick Riss’ gruppe ved Universitetet i Oslo, hvor de syntetiserte derivater av Ro 04-5595 og vi screenet dem i forhjernekultur fra kylling. Dette resulterte i oppdagelsen av flere nye GluN2B-spesifikke antagonister, som kan bli nyttige verktøy i forskning eller potensielle medikamenter i fremtiden.

 

Vi ønsket også å bruke kyllingmodellen i en farmakologisk setting, og kortidseksponerte kyllingembryo for morfin og metadon på dag 13 og 14 i egget. Deretter testet vi nivået av GluN2B-uttrykk i homogenisert lillehjerne på dag 17, samt NMDA-indusert Ca²⁺-influks i lillehjernekultur høstet dag 17 og testet på DIV 1. Vi undersøkte også GluN2B-uttrykket postnatalt hos rottebarn eksponert for buprenorfin og metadon gjennom hele svangerskapet. Hos kylling fant vi ingen økning av GluN2B-subenhet, men signifikant økning av NMDA-indusert Ca²⁺-influks. På dag 14 etter fødsel fant vi en forbigående økning i GluN2B-nivå hos rotter.

Diskusjon

Kyllingembryo regnes ikke som et forsøksdyr før 2/3 av gestasjonstiden har gått, og derfor bidrar bruk av embryo høstet på dag 10 til å redusere bruken av forsøksdyr, i tråd med 3R-prinsippene. I tillegg er ikke smertebanene utviklet på dette tidspunktet, noe som gjør kyllingembryo til et bedre alternativ med tanke på dyrevelferd. At NMDA-reseptorene har konservert oppbygning hos kylling og menneske, gjør kylling til en passende modell for å teste GluN2B-spesifikke antagonister. Det kan derimot ikke utelukkes at kylling har forskjellige sekundærbudbringersystemer, noe som kan gjøre det vanskelig å ekstrapolere forskning gjort på systemer nedstrøms av NMDA-reseptorene.

Når vi tok i bruk datamodellering for å undersøke bindingsegenskapene til antagonistene vi etablerte EC₅₀-verdiene for in vitro, måtte vi bruke molekylær dynamisk simulering for å sikre god kvalitet på resultatene. Dette ga oss mulighet til å simulere bindingene som dannes og bevegelsene til både ligand og reseptor over en gitt tidsperiode, men slik simulering er både datakapasitet- og tidkrevende. Dersom en kombinasjon av in silico- og in vitro-testing skal være effektiv, bør en bruke en superdatamaskin, eller ha tilgang til high-through-put screening-teknikker som gir resultater gode nok til å relateres til in vitro-forsøk.

Med et økende antall opioidavhengige mennesker verden over og forskning som viser at barn av mødre som misbruker opioider har utviklingsforstyrrelser, er det viktig å undersøke virkningen av opioider på hjernen i fosterlivet. Tidligere forskning har vist at økt Ca²-influks kan føre til endringer i hurtigheten på migrering av granulære nevroner fra det ytre til det indre laget av lillehjernen. Influks via NMDA-reseptorer påvirker i stor grad denne migrasjonen, hvor GluN2B er forbigående uttrykt akkurat når nevronene beveger seg (6). Hos rotte foregår denne prosessen fra postnatal dag 7–21 (7). Kanskje kan effekten vi observerte i kylling være med på å forklare den midlertidige endringen i GluN2B-uttrykk hos rotte på dag 14 etter fødsel? Dersom økt Ca²⁺-influks vedvarer i lang tid etter at opioideksponeringen er avsluttet, kan det føre til raskere migrasjon av nevroner og dermed prematur nedregulering av GluN2B-subenhet. Dette vil kunne være spennende å forske videre på.
 

Konklusjon

Vi har vist at forhjerne fra kylling er et pålitelig verktøy for forskning på NMDA-reseptorer. In vitro-data fra kylling i kombinasjon med in silico-modellering av antagonist-reseptorbinding gir spennende muligheter til å lære mer om antagonistenes kjemiske struktur og hvordan den påvirker binding til reseptoren. Vi oppdaget imidlertid at vi var nødt til å kjøre tidkrevende molekylære dynamiske simuleringer for å få resultater som kunne relateres til EC₅₀-verdiene vi etablerte for antagonistene i cellekultur.

Kortidseksponering med metadon eller morfin i kyllingembryo førte ikke til endring i GluN2B-nivå, men stimulerte til økt NMDA-indusert Ca²⁺-influks i cerebellærkultur høstet tre dager etter siste injeksjon av opioid. Kontinuerlig eksponering med metadon eller buprenorfin i rottebarn gjennom hele svangerskapet førte til en forbigående senkning av GluN2B-nivå på postnatal dag 14 hos gruppen som hadde vært utsatt for buprenorfin.

Både økning i Ca²⁺-influks i kylling og senkning av GluN2B-uttrykk hos rotte antas å være mediert av binding til opioidreseptor, da det ikke var statistisk signifikant forskjell mellom metadon og buprenorfin eller morfin.
 

Referanser

1. Sanz-Clemente A, Nicoll RA, Roche KW. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist 2013; 19: 62–75.
2. Narita M, Aoki T, Suzuki T. Molecular evidence for the involvement of NR2B subunit containing N-methyl-d-aspartate receptors in the development of morphine-induced place preference. Neuroscience 2000; 101: 601–6.
3. Ebert B, Andersen S, Krogsgaard-Larsen P. Ketobemidone, methadone and pethidine are non-competitive N-methyl-d-aspartate (NMDA) antagonists in the rat cortex and spinal cord. Neurosci Lett 1995; 187: 165–8.
4. Hedegaard M, Hansen KB, Andersen KT et al. Molecular pharmacology of human NMDA receptors. Neurochem Int 2012; 61: 601–9.
5. Stroebel D, Buhl DL, Knafels JD et al. A Novel Binding Mode Reveals Two Distinct Classes of NMDA Receptor GluN2B-selective Antagonists. Mol Pharmacol 2016; 89: 541–51.
6. Komuro H, Rakic P. Modulation of neuronal migration by NMDA receptors. Science 1993; 260: 95–7.
7. Hager G, Dodt HU, Zieglgänsberger W et al. Novel forms of neuronal migration in the rat cerebellum. J Neurosci Res 1995; 40: 207–19.

(Publisert i NFT nr. 4/2020 side 38–39.)