Utvikling av ny teknologi for effektiv opprensing av biologiske prøver før analyse

Bakgrunn og hensikt

Når biologiske prøver som blod, plasma, serum eller urin skal analyseres for å påvise eller bestemme nøyaktig konsentrasjon av et stoff (eksempelvis et legemiddel eller rusmiddel), er det viktig at prøvene opparbeides på riktig måte før analyse. Formålet er å forhindre at andre forbindelser som er til stede i prøven forstyrrer analysen og dermed påvirker analyseresultatet. Dette er helt essensielt i rettsmedisinsk sammenheng, hvor falske positive eller negative analyse-svar kan medføre alvorlige konsekvenser.

På Farmasøytisk institutt, Universitetet i Oslo, utvikles helt ny teknologi for dette. Teknikkene er såkalte mikroekstraksjonsteknikker, hvor legemidler og rusmidler isoleres fra komplekse biologiske prøver før de påvises med svært sensitive analyseinstrumenter.

I dette arbeidet ble det undersøkt om ekstraksjonsteknikkene kan anvendes for
et bredt utvalg av misbruksstoffer. Tradisjonelle rusmidler (amfetamin, morfin, kokain, etc.), benzodiazepiner, samt såkalte «nye psykoaktive stoffer» ble ekstrahert fra fullblod og plasma. Ekstraktene ble hovedsakelig analysert med væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), som er en populær analyseteknikk i bioanalyse. I tillegg ble det undersøkt om fosfolipider (naturlige fettstoffer i blodet) finnes igjen i ekstraktene etter elektromembranekstraksjon (EME) fra plasma, eller om de forblir i prøveløsningen. Fosfolipider påvirker ofte analysesignalet, særlig i LC-MS (1), og ekstrakter som ikke inneholder fosfolipider er derfor svært gunstig i bioanalytisk sammenheng.

 

Materiale og metode

Mikroekstraksjonene ble utført i et 96-brønnsformat (figur 1); altså kunne 96 prøver opparbeides samtidig. Stoffene ble ekstrahert i et 3-fase-system: fra en prøveløsning (100–250 µL), over en væskemembran (SLM fra supported liquid membrane), og videre inn i en akseptorløsning (50–150 µL) som til slutt ble analysert. Væskemembranen ble laget ved å påføre et lite volum organisk løsemiddel (3–5 µL) på det porøse filtermaterialet som dannet bunnen av brønnene i akseptorplaten. Før ekstraksjon ble donor- og akseptorplaten klemt sammen, og under selve ekstraksjonen stod hele oppsettet på en risteplattform som var innstilt på 900 omdreininger per minutt. Dette oppsettet var likt for de to teknikkene, men selve ekstraksjonsprinsippet var forskjellig da den ene teknikken ble utført med et pålagt elektrisk felt over væskemembranen.

1) Electromembrane extraction (EME): Stoffene ble ekstrahert ved elektrokinetisk migrasjon som følge av det pålagte elektriske feltet over væskemembranen (2). EME ble derfor utført med sure pH-betingelser i prøve- og akseptorløsningen for å sikre at de basiske rusmidlene var protonert (ladet) og dermed påvirket av det elektriske feltet. Utstyret bestod av en hjemmelaget 96-brønns donorplate i strømledende rustfritt stål og en kommersielt tilgjengelig 96-brønns akseptorplate. Platinaelektroder ble plassert enkeltvis i akseptorbrønnene. Det elektriske feltet bidro til rask ekstraksjon, og EME ble utført på 15 minutter (5, 7).

2) Parallel artificial liquid membrane extraction (PALME): Stoffene ble ekstrahert ved passiv diffusjon som følge av en pH-gradient (3). PALME av basiske rusmidler ble utført med basisk prøveløsning (høy pH) for å sikre at stoffene var deprotonert (uladet) og dermed mer løselige i den organiske væskemembranen. Sur akseptorløsning (lav pH) sørget derimot for at basene ble protonert (ladet) og mer vannløselige i grenseovergangen mellom væskemembranen og akseptorløsningen. Dette gjorde stoffene mer løselige i akseptorløsningen og hindret dem fra tilbake-ekstraksjon til væskemembranen. Utstyret bestod av kommersielt tilgjengelige 96-brønns donor- og akseptorplater, og PALME ble utført på 60 eller 120 minutter (6, 8).

Optimalisering av EME og PALME for de ulike rusmidlene innebar å optimalisere sammensetningen av prøveløsningen, væskemembranen og akseptorløsningen, i tillegg til å bestemme optimal ekstraksjonstid. For EME ble også den pålagte spenningen over væskemembranen vurdert. For høy spenning resulterte i ustabilt ekstraksjonssystem, og et voltmeter ble brukt for å bestemme hvor mange volt som kunne påsettes uten at strømmen i systemet overgikk den anbefalte grensen på 50 mikroampere. Strømmen i systemet ble i stor grad påvirket av den elektriske motstanden til væskemembranen. I dette arbeidet ble 2-nitrofenyloktyleter (NPOE) brukt som væskemembran, og spenningen over membranen var 20 volt.
 

Resultater

Dette arbeidet har vist at tradisjonelle rusmidler, benzodiazepiner og nye psykoaktive stoffer i plasma og fullblod kan ekstraheres med EME og PALME (5–8). Ulike strategier ble brukt for å optimalisere ekstraksjonene, og det ble blant annet vist at trioktylamin (5, 7) og bruk av løsemiddelkombinasjoner i væskemembranen (7) var en fordel i PALME, at trifluoreddiksyre (TFA) var svært gunstig som akseptorløsning i EME (6), og at modifisering av akseptorløsningen med det organiske løsemidlet dimetylsulfoksid (DMSO) økte utbyttene betraktelig i både EME og PALME (7, 8).

De endelige ekstraksjonsmetodene etterfulgt av LC-MS-analyse ble evaluert, med tilfredsstillende resultater for viktige parametere som linearitet, presisjon og nøyaktighet. Dette bekreftet påliteligheten til de eksperimentelle resultatene. PALME-metoden som ble optimalisert for benzodiazepiner ble dessuten sammenliknet med rutinemetoder ved Oslo universitetssykehus, og et Bland-Altman-plott viste god korrelasjon mellom PALME og rutinemetodene (7).

Ekstraktene etter EME fra plasma ble undersøkt for tilstedeværelse av fosfolipider. EME ble utført med tidligere optimaliserte ekstraksjonsbetingelser for basiske og sure stoffer, og i alle tilfeller var EME-ekstraktene frie for fosfolipider (4). I et parallelt prosjekt ble det samme vist for PALME (9).
 

Diskusjon

Rusmidlenes fettløselighet (log P) og basestyrke (pK_a) varierte i stor grad. Dette gjorde det interessant å undersøke om man kunne ekstrahere stoffene med EME og PALME. I begge teknikkene ønsker man å frakte stoffene over en organisk væskemembran. Høy nok fettløselighet (log P > 2,5) var derfor gunstig fordi stoffene da lett lot seg løse i væskemembranen. Hvis fettløseligheten derimot var for høy, ville stoffene kunne ha problemer med å komme videre over i akseptorløsningen. Her spilte basestyrken en rolle, da stoffenes vannløselighet øker betraktelig dersom de blir ladet (ionisert).

For basiske stoffer vil en lav pK_a-verdi bety at de krever tilsvarende lav pH for å bli ionisert. TFA, som er en svært sterk syre, viste seg å være gunstig som akseptorløsning i EME av svakt basiske benzodiazepiner, uten å påvirke stoffenes stabilitet (6). Overraskende nok var resultatet det motsatte for sterke baser, særlig de mest fettløselige (8). På grunn av dette oppstod hypotesen om at rusmidlene (som var positivt ladet) dannet ionepar med TFA (negativt ladet) i overgangen mellom væskemembranen og akseptorløsningen. Dette resulterte i svært fettløselige komplekser som dermed ble «fanget» i væskemembranen.

Redningen ble en mer fettløselig akseptorløsning: DMSO kombinert med 250 mM TFA (50:50, v/v). DMSO undertrykket ioniseringen av TFA og dermed også dannelsen av fettløselige komplekser. Modifisering av akseptorløsningen med DMSO var også gunstig i PALME (7), hvor optimalisert akseptorløsning var DMSO kombinert med 200 mM maursyre (75:25, v/v). Med utgangspunkt i dette kan det å modifisere akseptorløsningen bli en nyttig strategi ved fremtidig optimalisering av EME og PALME for svake syrer og baser.
 

Konklusjon

Dette arbeidet har bidratt til å føre EME og PALME noen skritt videre på veien mot det fremtidige målet om implementering i rutinelaboratorier. Resultatene representerer brikker i et større puslespill, og videre utvikling av teknikkene vil bli nødvendig i årene fremover. Målet er at teknikkene skal være i bruk i rutinelaboratorier innen 5–15 år, og kanskje til og med kombineres med mobiltelefoner, slik at «mannen i gata» kan gjøre målinger selv hjemme i stua og sende resultatet direkte til legen.
 

Referanser

1. Little JL, Wempe MF, Buchanan CM. Liquid chromatography–mass spectrometry/mass spectrometry method development for drug metabolism studies: examining lipid matrix ionization effects in plasma. J Chromatogr B 2006; 833: 219–30.
2. Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Electrokinetic migration across artificial liquid membranes: new concept for rapid sample preparation of biological fluids. J Chromatogr A 2006; 1109: 183–90.
3. Gjelstad A, Rasmussen KE, Parmer MP et al. Parallel artificial liquid membrane extraction: micro-scale liquid–liquid–liquid extraction in the 96-well format. Bioanalysis 2013; 5: 1377–85.
4. Vårdal L, Gjelstad A, Huang C et al. Efficient discrimination and removal of phospholipids during electromembrane extraction from human plasma samples. Bioanalysis 2017; 9: 631–41.
5. Vårdal L, Askildsen H-M, Gjelstad A et al. Parallel artificial liquid membrane extraction of new psychoactive substances in plasma and whole blood. J Chromatogr B 2017; 1048: 77–84.
6. Vårdal L, Øiestad EL, Gjelstad A et al. Electromembrane extraction of substances with weakly basic properties: a fundamental study with benzodiazepines. Bioanalysis 2018; 10: 769–81.
7. Vårdal L, Wong G, Øiestad ÅML et al. Rapid determination of designer benzodiazepines, benzodiazepines, and Z-hypnotics in whole blood using parallel artificial liquid membrane extraction and UHPLC-MS/MS. Anal Bioanal Chem 2018; 410: 4967–78.
8. Vårdal L, Øiestad EL, Gjelstad A et al. Electromembrane extraction with solvent modification of the acceptor solution: improved mass transfer of drugs of abuse from human plasma. Bioanalysis 2019; 11: 755–71.
9. Ask KS, Bardakci T, Parmer MP et al. Parallel artificial liquid membrane extraction as an efficient tool for removal of phospholipids from human plasma. J Pharmaceut Biomed 2016; 129: 229–36.

(Publisert i NFT nr. 7/2019 side 30–31.)