Farmakokinetisk variabilitet på vevsnivå

Bakgrunn og hensikt

Genetiske, fysiologiske og miljømessige faktorer kan påvirke fraksjonen av inntatt legemiddeldose som når systemisk sirkulasjon, i hvilken grad legemidlet distribueres til ulike vev og organer og hvor effektivt legemidlet elimineres fra kroppen. Farmakokinetiske prosesser utgjør derfor en viktig kilde til variasjon i legemiddelrespons mellom individer. Dette doktorgradsarbeidet besto av to delprosjekter med fokus på hver sin pasientgruppe hvor økt kunnskap om farmakokinetiske forhold er viktig. Vanligvis studeres farmakokinetikk ved å måle konsentrasjon av legemiddel i blodet over tid. I disse arbeidene var imidlertid fokus å studere mekanismer på vevsnivå ved bruk av humane biopsier.

Forekomsten av fedme øker og er nå over 20 prosent for Norges voksne befolkning. Mange av disse pasientene har fedmerelaterte sykdommer som krever legemiddelbehandling. En rekke fysiologiske endringer kan tenkes å bidra til endret farmakokinetikk i disse pasientene, men foreløpig har man begrenset kunnskap om hvorvidt legemiddelmetabolismen er påvirket (1). Den viktigste gruppen med legemiddelmetaboliserende enzymer er cytokrom P450 (CYP). Disse finnes hovedsakelig i lever og tynntarm, hvor de spiller en viktig rolle for førstepassasjemetabolismen av legemidler. Ettersom man sjelden har lever- og tarmbiopsier fra mennesker tilgjengelig, finnes det begrenset data på hepatisk og intestinal CYP-aktivitet i individuelle pasienter. Hensikten med det første delprosjektet var derfor å undersøke aktivitet av CYP-enzymer i parrede lever- og tarmprøver fra pasienter med fedme, samt å sammenlikne disse med enzymaktivitetene i biopsier fra pasienter uten fedme.

Kalsineurinhemmeren takrolimus er en viktig del av den immundempende behandlingen etter nyretransplantasjon. Ettersom takrolimus har et smalt terapeutisk vindu og dosebehovet varierer kraftig mellom pasienter, monitoreres konsentrasjonen av legemidlet i blod. Til tross for dette er nyretoksisitet en vanlig bivirkning som kan medføre sviktende organfunksjon over tid (2). Man vet foreløpig ikke hvorvidt dette kan skyldes akkumulering av takrolimus eller dens metabolitter i nyren. I det andre delprosjektet var hensikten derfor å utvikle en metode for å måle intrarenal konsentrasjon av takrolimus i nålbiopsier (2–8 mg) fra nyretransplanterte pasienter. Vi ønsket sekundært å måle intrarenal konsentrasjonen av metabolitter av takrolimus, samt mengden av P-glykoprotein (P-gp) – et transportprotein som finnes i nyrevevet og derfor kan tenkes å påvirke lokal eksponering av takrolimus.
 

Materiale og metoder

I det første delprosjektet (3) innhentet vi biopsier fra tynntarm og lever fra pasienter med fedme som gjennomgikk fedmekirurgi ved Sykehuset i Vestfold. I tillegg ble leverbiopsier innhentet fra pasienter uten fedme i forbindelse med kolecystektomi. Biopsiene ble homogenisert og subcellulær fraksjonering ble gjennomført for å oppkonsentrere enzymene. Aktivitet av sju CYP-enzymer (CYP3A4/5, CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 og CYP2D6) ble deretter analysert ved inkubasjon av mikrosomene med spesifikke probesubstrater og måling av metabolittdannelse.

I metodeutviklingen i det andre delprosjektet (4) benyttet vi humant nyrevev innhentet i forbindelse med nefrektomier ved Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet. Nyrehomogenat ble preparert ved bruk av «bead-beating». Konsentrasjon av takrolimus og metabolitter ble målt med væskekromatografi-massespektrometri og uttrykk av P-gp ble analysert med immunoblotting. Validering ble utført etter gjeldende retningslinjer for bioanalytiske metoder. Den ferdige metoden ble testet på reelle kliniske prøver, det vil si nyrebiopsier fra to nyretransplanterte pasienter behandlet med takrolimus.
 

Resultater

I delprosjekt 1 inkluderte vi 20 pasienter med fedme. Vi fant stor interindividuell variasjon i CYP-aktiviteter både i lever og tarm (opptil 55 ganger forskjell mellom pasientene). Aktivitetene av de ulike CYP-enzymene i lever var som ventet betydelig høyere enn de respektive aktivitetene i tynntarm. For CYP3A var imidlertid aktivitetene i lever og tarm sammenliknbare. Videre fant vi at det i liten grad var sammenheng mellom aktivitetene i lever og tarm – altså hadde en pasient med høy CYP3A-aktivitet i lever ikke nødvendigvis også høy aktivitet i tarm. Derimot var det positive korrelasjoner mellom aktivitetene av flere ulike CYP-enzymer innad i hvert organ. I tillegg inkluderte vi 16 pasienter uten fedme. Vi fant en signifikant negativ korrelasjon mellom total kroppsvekt og aktivitet av CYP3A i lever. Derimot fant vi ingen sammenheng mellom kroppsstørrelse og aktivitet av de øvrige CYP-enzymene som ble undersøkt.

I delprosjekt 2 utviklet vi en metode for å kvantifisere konsentrasjonen av takrolimus i små nyrebiopsier. Validering viste at den tilfredsstilte kravene til en bioanalytisk metode. Videre fant vi at konsentrasjonen av hovedmetabolittene og proteinuttrykket av P-gp kunne bestemmes semikvantitativt i den samme nyrebiopsien. Ved anvendelse av metoden på nyrebiopsier fra to nyretransplanterte pasienter fant vi at metoden var godt egnet for bruk på kliniske prøver.
 

Diskusjon

Til tross for at leveren har et mye høyere innhold av CYP-enzymer enn tarmen, bidrar tarmen betydelig til metabolismen av enkelte CYP3A-substrater (5). I delprosjekt 1 fant vi sammenliknbare aktiviteter av CYP3A i lever og tarm, noe som kan indikere at tarmen spiller en viktig rolle i førstepas-sasjemetabolismen av CYP3A-substrater også i pasienter med fedme. Videre kan den manglende assosiasjonen mellom aktivitet i de parrede prøvene tyde på at ulik regulering av CYP-enzymene finner sted i tarm og lever. Derimot viste resultatene at det kan være en større grad av felles regulering for de ulike CYP-enzymene innad i hvert organ. Den store interindividuelle variabiliteten i CYP-aktivitet i både lever og tarm kan være en utfordring med tanke på individuell dosering av legemidler som er CYP-substrater. Det er derfor av interesse å definere faktorer som kan bidra til å predikere CYP-aktivitet i den enkelte pasient. Disse resultatene indikerer at CYP3A-aktivitet i lever reduseres med økende grad av fedme. Dette er i tråd med en tidligere studie hvor man så på uttrykk av CYP3A4-enzymer (6) og indikerer at forsiktighet bør utvises ved dosering av CYP3A-substrater med smalt terapeutisk vindu til pasienter med fedme, spesielt for legemidler som doseres etter kroppsvekt. Det er imidlertid også mange andre faktorer som påvirker CYP3A-aktivitet, slik som genetikk, kjønn og diett, og den kliniske relevansen av dette funnet må derfor studeres videre. Dette arbeidet er en del av et større prosjekt hvor et av målene er å studere effekten av kroppsvekt på farmakokinetikk («COCKTAIL-studien») (7). I disse pasientene har vi dermed også undersøkt disposisjonen av CYP-substrater in vivo ved å studere blodkonsentra-sjoner av utvalgte legemidler etter inntak. Genetiske varianter av CYP-enzymene, samt mengden av enzymene i vevene er også undersøkt. I det videre arbeidet skal disse dataene integreres via fysiologibasert farmakokinetisk modellering med mål om å identifisere faktorer som predikerer legemiddeldisposisjon i pasientene.

Selv om takrolimus reduserer risikoen for akutte rejeksjoner og bidrar til gode korttidsresultater etter nyretransplantasjon, medvirker samtidig bivirkninger, slik som nyretoksisitet, til at langtidsresultatene ikke er optimale (8). I klinikken justeres dosen etter bunnkonsentrasjoner av takrolimus i blod. Man har imidlertid ikke funnet en klar sammenheng mellom systemisk eksponering av takrolimus og nyreskade, og interessen for å måle takrolimus i andre biologiske matrikser er økende. Ved bruk av en enkelt nålbiopsi fra den transplanterte nyren kan vi ved hjelp av metoden som ble utviklet i delprosjekt 2 studere mulige mekanismer bak utvikling av takrolimus-indusert nyretoksisitet. I en planlagt klinisk studie skal metoden anvendes for å undersøke om det er en sammenheng mellom intrarenal konsentrasjon av takrolimus og grad av nyreskade i nyretransplanterte pasienter. Videre skal betydningen av takrolimus metabolitter og P-gp studeres. På sikt er det ønskelig å kunne forutsi hvilke pasienter som er mest utsatt for å utvikle denne type bivirkning. Dette er imidlertid ikke en metode som er egnet for bruk i klinisk praksis, ettersom biopsitaking er en invasiv prosedyre forbundet med risiko for blødning. Dersom vi finner at den intrarenale eksponeringen av takrolimus er relevant, er det derfor interessant å utvikle farmakokinetiske modeller som kan predikere lokal eksponering av takrolimus basert på informasjon om den enkelte pasient.

En viktig begrensing ved disse arbeidene er at funn i små biopsier ikke nødvendigvis er representative for hele organet, og at det derfor kan være vanskelig å ekstrapolere resultatene til in vivo-forhold.
 

Konklusjon

Resultatene i disse arbeidene bidrar til økt forståelse av interindividuell variasjon i disposisjon og respons av legemidler, noe som på sikt kan være med på å optimalisere legemiddelbehandlingen for den enkelte pasient.
 

Referanser

1. Smit C, De Hoogd S, Bruggemann RJM et al. Obesity and drug pharmacology: a review of the influence of obesity on pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters. Expert Opin Drug Metab Toxicol 2018; 14: 275–85.
2. Naesens M, Kuypers DR, Sarwal M. Calcineurin inhibitor nephrotoxicity. Clin J Am Soc Nephrol 2009; 4: 481–508.
3. Krogstad V. Studies of hepatic, intestinal and renal pharmacokinetic processes contributing to variability in drug disposition and response. Doktoravhandling. Oslo: Farmasøytisk institutt, Universitetet i Oslo, 2018.
4. Krogstad V, Vethe NT, Robertsen I et al. Determination of Tacrolimus Concentration and Protein Expression of P-Glycoprotein in Single Human Renal Core Biopsies. Ther Drug Monit 2018; 40: 292–300.
5. Paine MF, Khalighi M, Fisher JM et al. Characterization of interintestinal and intraintestinal variations in human CYP3A-dependent metabolism. J Pharmacol Exp Ther 1997; 283: 1552–62.
6. Ulvestad M, Skottheim IB, Jakobsen GS et al. Impact of OATP1B1, MDR1, and CYP3A4 expression in liver and intestine on interpatient pharmacokinetic variability of atorvastatin in obese subjects. Clin Pharmacol Ther 2013; 93: 275–82.
7. Hjelmesæth J, Åsberg A, Andersson S et al. Impact of body weight, low energy diet and gastric bypass on drug bioavailability, cardiovascular risk factors and metabolic biomarkers: protocol for an open, non-randomised, three-armed single centre study (COCKTAIL). BMJ open 2018; 8: e021878.
8. Nankivell BJ, P’Ng CH, O’Connell PJ et al. Calcineurin inhibitor nephrotoxicity through the lens of longitudinal histology: comparison of cyclosporine and tacrolimus eras. Transplantation 2016; 100: 1723–31.

(Publisert i NFT nr. 8/2019 side 38–39.)