Fotokjemiske strategier for eliminasjon av kreftceller

Last ned hele artikkelen i PDF-format med figur. (777KB)

Bakgrunn og hensikt

Legemiddelresistens er en utfordring i dagens kreftbehandling. Dette begrenser behandlingseffekten og fører til tilbakefall i kreft­pasienter. Det er derfor et behov for å utvikle nye kreft­behandlingsstrategier som forbedrer responsen og omgår resistens. En tilnærming er å bruke metoden fotokjemisk internalisering (PCI). PCI-teknologien er en legemiddelleveringsmetode utviklet for intracellulær levering av legemidler ved hjelp av fotosensitiser, et lysfølsomt stoff, og lys. Prinsippene er basert på foto­dynamisk terapi (PDT) som brukes ­klinisk i behandling av visse krefttyper. Fotosensitisere aktiveres ved hjelp av lys som videre danner reaktive ­oksygenforbindelser (ROS). ROS kan ødelegge omliggende cellestrukturer og vev. Fotosensitisere utviklet for PCI-­metoden ­lokaliseres til membranen på endocytiske vesikler i celler og kan kombineres med ­legemidler som er fanget i vesikler for å frigi legemidlet til cytosol ved hjelp av lysaktivering. ROS-dannelsen ødelegger vesikkelmembranen og man får dermed frigitt legemidlet intracellulært (figur 1). Tidligere forskning har vist at PCI-metoden er svært effektiv i kombinasjon med makromolekyler (1). Makromolekyler kan ikke passere cellemembranen på grunn av ­størrelsen og blir tatt opp i celler via endocytiske vesikler. Legemidler som ­lokaliseres i endocytiske vesikler blir over tid brutt ned. Det er ­imidlertid ikke bare makromolekyler som ­lokaliseres i endocytiske vesikler; lipofile legemidler med basiske egenskaper kan også bli fanget i endocytiske vesiklene på grunn av relativ lav pH i vesiklene.

Hensikten med doktorgradsarbeidet var å kombinere markedsførte og eksperimentelle legemidler med PCI-teknologien og ­evaluere effektene preklinisk. Den klinisk relevante PCI-fotosensitiseren TPCS_2a/Fimaporfin ble benyttet i dette arbeidet.

Materiale og metoder

Forsøkene ble utført in vitro på ulike kreftceller i kultur. For å aktivere fotosensitiseren TPCS_2a ble det benyttet lys fra en lampe. Effektiviteten av behandlingen ble målt ved hjelp MTT-assay som måler viabilitet og klonal celleoverlevelse. Fluorescensmikroskopi ble brukt for å studere den intracellulære lokaliseringen av TPCS_2a og/eller legemidlene. Flowcytometri ble brukt for evaluering av overflate/intracellulære ­markører og ble også benyttet til celle­sortering. I in vivo-forsøk i muse­modeller ble tumorer ­e­tablert ved subkutan injeksjon av kreftceller i låret. Musene med tumor ble belyst med laser for aktivering av fotosensitiser og effekten ble monitorert ved tumormåling.
 

Resultater

I første del av arbeidet ble det benyttet ­tyrosinkinasehemmeren (TKI) sunitinib i kombinasjon med PCI (2). Flere TKI, deriblant ­sunitinib, lokaliseres i sure endocytiske vesikler på grunn av de lipofile og basiske egen­skapene, og er dermed aktuelle legemiddel­kandidater for PCI (3). In vitro-forsøkene indikerte at sunitinib er fotolabil og blir ­ødelagt av ROS fra aktivert ­fotosensitiser. Foto­ødeleggelsen av sunitinib kunne omgås ved å endre belysningsrekkefølgen. Lysaktivering av TPCS_2a før ­sunitinib-inkubasjon var effektiv in vitro. Denne kombinasjonen ble videre studert i ­immunkompetente mus hvor PCI av sunitinib ikke var bedre enn monoterapi. Evaluering av T-cellene i tumorene viste at PCI av sunitinib førte til antagonistisk effekt på tumor-infiltrerende T-celler og kan forklare overlevelsesdataene (2). Basert på disse funnene ble ikke sunitinib benyttet videre.

Videre i arbeidet evaluerte vi enzymet aldehyddehydrogenase (ALDH) som er en kreftstamcellemarkør. Kreftstamceller med høy ALDH-ekspresjon er assosiert med ­legemiddelresistens og dårligere behandlingsrespons i pasienter. Kreftceller med høy eller lav ALDH-ekspresjon ble sortert med flow­cytometri og behandlet med TPCS_2a-PDT. Dataene viste at høyt ALDH-uttrykk ikke påvirket TPCS_2a-PDT-responsen, og styrker dermed videre bruk av TPCS_2a mot resistente kreftstamceller (4).

I den tredje artikkelen ble all-trans retinsyre (ATRA), evaluert i kombinasjon med TPCS_2a-PDT da ATRA kan redusere ALDH-uttrykket i kreftceller. Her omtales kombinasjonen som PDT da det ikke er kjent om dette legemidlet lokaliseres i vesikler. Effekten av TPCS_2a og ATRA reduserte proliferasjon, viabilitet og ­klonal celleover­levelse in vitro i kreftceller. Den eksakte virkningsmekanismen ble ikke avdekket i ­forsøkene, men RNA-sekvenseringsdata peker på at økt apoptose og økt cellulær stressrespons som mulige mekanismer. In vivo-­forsøk i ­atymiske dyr reduserte tumorstørrelsen signifikant opptil 20 dager etter behandling. I tillegg oppnådde to av fem mus kurasjon i kombinasjonsgruppen (5).

I siste del av arbeidet evaluerte vi et immunotoksin in vitro. Toksinet er et eksperimentelt legemiddel med en målstyringsenhet rettet mot den humane PD-L1-reseptoren og er koblet til et toksin kalt saporin som hemmer protein­syntese i cytosol. PD-L1 er en negativ regulator av immunresponser og er høyere uttrykt på en rekke kreftceller. Studier tyder på at reseptoren internaliseres og er derfor relevant for PCI-­metoden (6). Fluorescensmikroskopi bekreftet at PD-L1-reseptoren internaliseres over tid i og lokaliseres i endocytiske vesikler sammen med fotosensitiseren TPCS_2a. Videre viste fluorescensmikroskopi-bildene at lysaktivering av TPCS_2a ødela vesiklene og redistribuerte PD-L1 til cytosol. Cellestudier i humane kreft­cellelinjer viste at PCI av anti-PD-L1-saporin var svært effektiv i pico-nanomolarkonsentrasjon i kreftceller med høyt PD-L1-uttrykk (7).
 

Diskusjon

PCI-teknologien har siden første publikasjon i 1999 blitt evaluert i kombinasjon med en rekke legemidler. Dette doktorgrads­arbeidet indikerer at sunitinib ikke egner seg i kombinasjon med PCI. Belysnings­rekkefølgen hadde stor ­betydning for PCI-effekten av sunitinib in vitro. I dyreforsøk hadde kombinasjonen overraskende liten effekt sammenliknet med kontrollgruppene. Den antagonistiske effekt på tumorinfiltrerende T-celler ble pekt på som årsak til manglende respons.

Arbeidet har også pekt på andre lovende legemiddelkandidater som kan kombineres med PCI-fotosensitiseren TPCS_2a; ATRA og et immunotoksin mot PD-L1. Kombinasjonen ATRA og TPCS_2a-PDT viste lovende resultater, men en alternativ legemiddelformulering er nødvendig for videre forskning. Legemidlet er lipofilt, noe som gjør administrasjon utfordrende. Virkningsmekanismen(e) av ATRA og TPCS_2a-PDT bør også studeres nærmere.

PCI av PD-L1-immunotoksinet viste også lovende resultater basert på in vitro-dataene og effektene bør evalueres videre i dyremodeller. Immunotoksinet som ble brukt i denne studien kan ikke brukes i dyremodeller på grunn av molekylærvekten. Den relativ høye ­molekylærvekten vil føre til begrenset ­tumordistribusjon. Utvikling av et mindre immunotoksin mot PD-L1 i mus er nødvendig for å kunne studere denne med PCI i en immunokompetent modell.
 

Konklusjon

Dette doktorgradsarbeidet består av såkalte proof of concept-studier som har bidratt til økt innsikt i videreutviklingen av nye foto­kjemisk-baserte kreftbehandlinger. Studiene har pekt på noen legemiddelkandidater som kan være lovende i kombinasjon med fotosensitiseren TPCS_2a og stimulerer til videre forskning.
 

Referanser

1. Jerjes W, Theodossiou TA, Hirschberg H et al. Photochemical internalization for intracellular drug delivery. From basic mechanisms to clinical research. J Clin Med 2020; 9: 528.
2. Wong JJW, Berstad MB, Fremstedal ASV et al. Photochemically-induced release of lysosomal sequestered sunitinib: obstacles for therapeutic efficacy. Cancers (Basel) 2020;12: 417.
3. Zhitomirsky B, Assaraf YG. Lysosomes as mediators of drug resistance in cancer. Drug Resist Updat 2016; 24: 23–33.
4. Wong JJW, Selbo PK. High aldehyde dehydrogenase activity does not protect colon cancer cells against TPCS_2a-sensitized photokilling. Photochem Photobiol Sci 2020; 19: 308–12.
5. Wong JJW, Lorenz S, Selbo PK. ATRA improves the anti-tumor effect of photodynamic therapy. Manuscript in preparation.
6. Burr ML, Sparbier CE, Chan YC et al. CMTM6 maintains the expression of PD-L1 and regulates anti-tumour immunity. Nature 2017; 549: 101–5.
7. Wong JJW, Selbo PK. Light-controlled elimination of PD-L1+ cells. J Photochem Photobiol B 2021; 225: 112355.

(Publisert i NFT nr. 4/2022 side 40–41)