Doktoravhandling

Tittel
Pharmacological and genetic approaches to modulate energy metabolism in skeletal muscle cells
http://urn.nb.no/URN:NBN:no-97103

Emne
Farmakologi

Stipendiat
Christine Skagen, Avdeling for immunologi og transfusjonsmedisin, Oslo universitetssykehus.
E-post: christine.skagen@medisin.uio.no

Veiledere
Hege Thoresen, Farmasøytisk institutt, Universitetet i Oslo (UiO); Arild C. Rustan, Farmasøytisk institutt, UiO; Eili Tranheim Kase, Farmasøytisk institutt, UiO, og Xiao-Rong Peng, AstraZeneca, Sverige.

Sted og tidspunkt for disputas
Universitetet i Oslo, vår 2022

Hovedbudskap

Forstyrrelser av metabolske prosesser i skjelettmuskel kan bidra til utviklingen av type 2-diabetes.

Aktivering av β₂-adrenerge reseptorer og termoreseptoren TRPA1 øker glukoseopptaket i skjelettmuskel.

Hemming av de metabolske enzymene adenosin-monofosfat-proteinkinase og
diasylglyserol-acyltransferase 1 og 2 hadde merkbare effekter på lipidmetabolismen.



Bakgrunn og hensikt

Forekomsten av overvekt og fedme har økt drastisk de siste tiårene. Fedme er assosiert med utviklingen av en rekke andre sykdommer. Av den grunn har det blitt et behov for legemidler som kan øke energimetabolismen og dermed bidra til vektnedgang.

Skjelettmuskel er et av kroppens største organer og er hovedorganet for forbrenning av fettsyrer og glukose. Under hvile og lengre utholdenhetstrening er det hovedsakelig fettsyrer som blir brukt som energikilde, mens etter et måltid og i respons til muskelkontraksjoner er glukose det foretrukne substratet. Skjelettmuskel må kunne bytte raskt mellom forbrenningen av fettsyrer og glukose. Dette kalles metabolsk fleksibilitet. Om lag 80 prosent av insulinstimulert glukoseopptak foregår i skjelettmuskel, noe som gjør det kvantitativt sett det viktigste organet når det kommer til utviklingen av redusert insulinfølsomhet (insulinresistens). I tillegg vil skjelettmuskel bidra til kroppens temperaturregulering ved å produsere varme ved å øke energimetabolismen. Metabolske forstyrrelser i skjelettmuskulaturen, som redusert glukoseopptak som et resultat av insulinresistens, forstyrrelser i fettsyreforbrenningen og redusert metabolsk fleksibilitet er assosiert med fedme og utviklingen av type 2-diabetes (T2D) (1).

Glukose blir tatt opp i skjelettmuskelceller via glukosetransportører (GLUT). GLUT-1 er hovedansvarlig for det basale glukoseopptaket i skjelettmuskelceller, mens under insulinstimulerte forhold er GLUT4 viktigst. Etter å ha blitt tatt opp i muskelcellene kan glukose enten bli lagret som glykogen eller bli brutt ned via oksidasjon for å produsere energi i form av ATP. Fettsyrer blir også tatt opp i skjelettmuskelceller via spesialtransportører. Fettsyrer kan enten bli oksidert for å generere ATP eller bli lagret som diasylglyserol (DAG) og triasylglyserol (TAG) i lipiddråper. I tilfeller der det er et høyt energibehov så blir glykogen og fettsyrer i lipiddråper frigjort for energiproduksjon.
 

Materialer og metoder

Satellittceller ble isolert fra muskelbiopsier fra unge friske menn eller genmodifiserte mus og dyrket i laboratoriet som en in vitro-modell av skjelettmuskel (2). Under dyrkningen ble cellene tilsatt ulike virkestoffer som potensielt kunne påvirke energimetabolismen. Deretter ble det gjennomført ulike forsøk med cellene der cellenes egenskaper etter behandlingen ble undersøkt. Omsetningen av glukose og fettsyrer ble studert ved hjelp av radioaktive isotoper. Endringer i gen- og proteinuttrykk ble studert ved hjelp av henholdsvis kvantitativ PCR og proteomikkanalyse med LC-MS.
 

Resultater

Artikkel 1
Tidligere in vivo-studier har beskrevet flere metabolske fordeler ved bruk av β₂-adrenerge agonister i muskel, som for eksempel økt glukoseopptak, mitokondriell biogenese og oksidasjon av fettsyrer, men om disse effektene er direkte eller indirekte, er uklart. I denne studien ble muskelceller i kultur behandlet med den β₂-adrenerge agonisten terbutalin. Behandling med terbutalin økte opptaket av glukose i cellene, og det ble også observert økt forbrenning av både glukose og fettsyrer. I tillegg ble det observert økt inkorporering av aminosyren leucin i cellulært protein, som kan tyde på en økt proteinsyntese. Proteomikkanalyse viste økt utrykk av proteiner involvert i flere metabolske prosesser i mitokondriene. Interessant nok så ble det også målt en økning av fruktosetransportør GLUT5, noe som ifølge tidligere studier kan bidra med å øke glukoseopptaket (3).


Artikkel 2
Kulde blir registrert gjennom termoreseptorene transient receptor potential channel ankyrin 1 (TRPA1) og transient receptor potential channel melastatin 8 (TRPM8) som etter aktivering setter i gang en varmeproduserende prosess kalt termogenese. Termogenesen er et resultat av aktivering av en rekke gener som er knyttet til temperaturregulering. Selv om aktiveringen av TRPA1 og TRPM8 har blitt beskrevet til å være avhengig av nervesystemet, har andre studier funnet at disse reseptorene kan aktiveres direkte i andre vev uavhengig av nervestimuli. I tillegg til å bli aktivert av kulde, så kan TRPA1 og TRPM8 aktiveres av kjemiske agonister. Ligustilide ble brukt for å aktivere TRPA1, mens icilin og mentol ble brukt til å aktivere TRPM8. Ved å bruke konfokal mikroskopi for å studere kalsium-tilstrømning ble det bekreftet at TRPA1 og TRPM8 kan aktiveres i skjelettmuskelceller uten involvering av nervesystemet. Når TRPA1 ble aktivert av ligustilide, resulterte det i et økt opptak og oksidasjon av glukose, mens aktivering av TRPM8 av icilin og mentol hadde motsatt effekt. TRPA1-aktivering med ligustilide hadde ingen effekter på uttrykket av temperaturregulerende gener, noe som tyder på at andre effekter enn genregulering er involvert.

Artikkel 3
Enzymene diasylglyserol-acyltransferase (DGAT)1 og DGAT2 katalyserer det siste steget i syntesen av TAG. Selv om DGAT1 og DGAT2 katalyserer den samme prosessen, har de ulike roller i ulike vev. I tillegg er deres rolle i skjelettmuskel dårlig definert. Målet i denne studien var å studere rollene til DGAT1 og DGAT2 i skjelettmuskel ved hjelp av farmakologiske hemmere. Det ble funnet at DGAT1 og DGAT2 har distinkte roller i lipidmetabolismen. Begge enzymene er involvert i de novo-TAG-syntese og begge er viktige for graden av fettsyreoksidasjon, og DGAT1 er viktigst for inkorporeringen av fettsyrer inn i DAG og TAG.

Artikkel 4
Adenosin-monofosfat-proteinkinase (AMPK) er et enzym som fungerer som en cellulær energisensor, dermed er det viktig for metabolsk homeostase. AMPK er et heterotrimert enzym som består av en katalytisk α-subenhet og to regulatoriske β- og γ-subenheter. Det finnes to isoformer av α-subenheten (α1 og α2), og i skjelettmuskel er α2 den viktigste isoformen. I denne studien ble genet som koder for α2 subenheten fjernet («knocket ut») i mus, deretter muskelceller isolert (AMPKα2-/-). Muskelceller ble også isolert fra kontrollmus (AMPKα2+/+). Muskelceller fra AMPKα2-/-mus hadde en høyere basal oksidativ kapasitet, men en redusert respons til mitokondriell frikobling og en lavere metabolsk fleksibilitet enn muskelceller fra kontrollmus. Celler fra AMPKα2-/--mus hadde i tillegg lavere akkumulasjon av lipider og en redusert inkorporering av fettsyrer i komplekse lipider, økt uttrykk av proteiner relatert til metabolske prosesser i mitokondria, og økt av uttrykk av karnitin-palmitoyltransferase, enzymet som er ansvarlig for å frakte fettsyrer inn i mitokondriene.
 

Diskusjon

Forekomsten av fedme og relaterte sykdommer, blant annet type 2-diabetes, har økt drastisk de siste tiårene. Livsstilsendring og vektnedgang kan være effektivt for å forebygge og behandle type 2-diabetes, men er ofte vanskelig å få til. Det kan derfor være aktuelt å utvikle legemidler som kan øke energimetabolismen og dermed bidra til vektnedgang. Skjelettmuskel er ett av de mest metabolsk aktive organene og kan dermed være et interessant angrepspunkt for legemidler.

Resultatene fra de to første artiklene viser at det er mulig å øke glukoseopptaket i skjelettmuskelceller ved å aktivere reseptorer i cellemembranen. Ved å aktivere β₂-adrenerge reseptorer (β₂-AR) og termoreseptoren TRPA1 økte glukoseopptaket. Tidligere studier har tydet på at det økte glukoseopptaket sett etter stimulering av β₂-AR er et resultat av aktivering av signalveier som resulterer i GLUT4-translokasjon og AMPK-aktivering (4, 5). Det er ukjent hvilke mekanismer som står bak det økte opptaket og oksidasjonen av glukose sett etter TRPA1-aktivering, men det er trolig et resultat av forhøyet kalsium-tilstrømning (6). Det som er viktig ved disse funnene er at de underliggende mekanismene er insulinuavhengige og dermed interessante for utviklingen av nye legemidler mot type 2-diabetes.

Akkumulering av lipiddråper i skjelettmuskel har vist seg å bidra til insulinresistens og utviklingen av type 2-diabetes (7). Mine resultater viser at ved å hemme de metabolske enzymene DGAT1 og AMPK ble akkumulering og inkorporering av fettsyrer inn i DAG og TAG redusert. DGAT1 er ansvarlig for å katalysere dannelsen av TAG, og ved å hemme DGAT1 var en nedgang i TAG forventet, mens nedgangen i DAG tyder på at DGAT1 også har en rolle i inkorporeringen av eksogene og endogene fettsyrer inn i disse komplekse lipidene. Det er uvisst hvilken rolle AMPK har i inkorporering av fettsyrer i komplekse lipider da AMPK er proteinkinase som regulerer mange metabolske prosesser (8). Det er også verdt å nevne at oksideringen av fettsyrer var mye høyere i AMPKα2-/- myotuber, mens akkumuleringen av fettsyrer var lavere. Det kan dermed være mulig at AMPK har en rolle i lipidmetabolisme-homeostasen. Med tanke på sammenhengen mellom lipidakkumulering og insulinresistens kan det være interessant å bremse denne prosessen, men det viktig å ta i betrakting andre roller disse enzymene har i ulike fysiologiske prosesser. Manipulering av enzymene kan imidlertid være hjelpemidler for å studere ulike prosesser som kan påvirke lipidakkumulering i skjelettmuskelceller.
 

Konklusjon

Overvekt og fedme øker risikoen for flere sykdommer, inkludert type 2-diabetes. Ett av organene som bidrar til utviklingen av type 2-diabetes er skjelettmuskulaturen. Resultatene presentert i denne avhandlingen viser at energimetabolisme i skjelettmuskel kan bli påvirket av legemidler som aktiverer reseptorer på celleoverflaten samt genetiske endringer av metabolske enzymer. Disse funnene kan bidra til å finne angrepspunkter som kan bli brukt i utviklingen av nye legemidler mot fedme og type 2-diabetes.
 

Referanser

  1. Koves TR et al. Mitochondrial overload and incomplete fatty acid oxidation contribute to skeletal muscle insulin resistance. Cell Metab 2008; 7: 45–56.
  2. Lund J et al. Glucose metabolism and metabolic flexibility in cultured skeletal muscle cells is related to exercise status in young male subjects. Arch Physiol Biochem 2018; 124: 119–30.
  3. Kayano T et al. Human facilitative glucose transporters. Isolation, functional characterization, and gene localization of cDNAs encoding an isoform (GLUT5) expressed in small intestine, kidney, muscle, and adipose tissue and an unusual glucose transporter pseudogene-like sequence (GLUT6). J Biol Chem 1990; 265: 13276–82.
  4. Chia LY et al. Adrenoceptor regulation of the mechanistic target of rapamycin in muscle and adipose tissue. Br J Pharmacol 2019; 176: 2433–48.
  5. Meister J et al. Clenbuterol exerts antidiabetic activity through metabolic reprogramming of skeletal muscle cells. Nat Commun 2022; 13: 22.
  6. Clapham DE. Calcium signaling. Cell 2007;131: 1047–58.
  7. Goodpaster BH, Wolf D. Skeletal muscle lipid accumulation in obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes. Pediatr Diabetes 2004; 5: 219–26.
  8. Zhang BB, Zhou G, Li C. AMPK: an emerging drug target for diabetes and the metabolic syndrome. Cell Metab 2009; 9: 407–16.
     

(Publisert i NFT nr. 1/2023 side 28–29)