Mulige angrepspunkter for nye vektreduserende legemidler – effekter av in vitro-trening og manipul­ering av ­varmeproduksjon i skjelettmuskel

Bakgrunn og hensikt

Forekomsten av overvekt og fedme er i sterk vekst over hele verden, og i Norge er det i dag flere med overvekt og fedme enn normalvektige (1). Fedme utgjør en økt risiko for utvikling av en rekke sykdommer som hypertensjon, type 2-diabetes, hjerte- og karsykdommer samt ulike kreftformer, og bidrar dermed betydelig til sykelighet og dødelighet i befolkningen. På den annen side er det kjent at økt fysisk aktivitet anses å være et viktig virkemiddel for å forebygge og behandle fedme og assosierte sykdommer.

Ved enhver omtale av fysisk aktivitet og trening vil skjelettmuskulaturen, som utgjør 40–50 % av kroppsvekten, ha en sentral rolle. Dette organet er blant annet hovedansvarlig for omtrent 80 % av det insulinstimulerte glukoseopptaket i kroppen (2) og er et viktig organ ved utvikling av metabolske sykdommer som fedme og type 2-diabetes. De molekylære mekanismene som ligger bak muskulaturens tilpasning til fysisk aktivitet er ikke fullt klarlagt. Initieringen av muskeladaptasjon starter imidlertid med de tidlige signaler assosiert med muskler som kontraherer, og induserer nedstrøms kinaseaktivering og regulering av genuttrykk. Muskelkontraksjon avhenger av frigjøring av kalsium (Ca²⁺) fra sarkoplasmatisk retikulum (SR) og en økning i cytosolisk Ca²⁺-konsentrasjon (figur 1). Som respons på økte Ca²⁺-konsentrasjon i cytosol aktiveres sarkoplasmatisk retikulum Ca²⁺-ATPase (SERCA) pumpen, Ca²⁺ vil pumpes fra cytoplasma tilbake til lumen av SR, og dette fører til muskelavslapping (3). SERCA-pumpen krever hydrolyse av ett ATP-molekyl for transport av to Ca²⁺-ioner. Langvarig eller kontinuerlig aktivering av SERCA-pumpen resulterer i økt forbruk av ATP og forhøyet temperatur. SERCA-pumpeaktiviteten kan forsterkes ytterligere ved tilstedeværelsen av proteiner som fosfolamban (PLB) og sarkolipin (SLN) (3).

Nylige studier i dyremodeller har vist at SLN har en mulige rolle ved regulering av termogenese (varmeproduksjon) og energimetabolisme i skjelettmuskulatur ved å fremme avkobling av SERCA-pumpen fra Ca²⁺-transport, noe som gir energisløsende («futile») mekanisme med økt ATP hydrolyse og varmeproduksjon (figur 1) (4). Resultatene fra disse studiene viste at energiforbruket var betydelig høyere i en musemodell som overuttrykker SLN sammenliknet med en musemodell hvor genet til SLN var fjernet («knockout»), noe som tyder på at SLN er en viktig faktor som kan øke energimetabolismen i muskel.

Tidligere studier har også vist at skjelettmuskel har evnen til å produsere og skille ut signalstoffer, kalt myokiner, til blodomløpet som et resultat av muskelkontraksjon ved trening (5). Disse myokinene har evnen til å påvirke andre vev og organer som lever, bukspyttkjertel og fettvev i tillegg til skjelettmuskelen selv. De senere årene har det vært økt fokus på disse myokinenes rolle i sykdomsforebygging. Hypotesen er at frisetting av disse myokinene er hovedmekanismen for de gunstige helseeffektene av trening, men kunnskap om hvilke myokiner som påvirker hvilke vev og på hvilken måte er fortsatt begrenset.

Hovedmålet med doktorgradsarbeidet var å undersøke hvordan farmakologisk og genetisk modulering av SERCA-pumpen påvirker glukose- og lipidomsetningen i humane skjelettmuskelceller i kultur. Vi ønsket også å identifisere molekylære endringer og signalveier som ligger bak de gunstige metabolske effektene av trening.
 

Materiale og metoder

Humane skjelettmuskelceller ble benyttet i alle tre artiklene som utgjorde doktorgradsarbeidet. Satellittceller ble først isolert fra muskelbiopsier fra friske frivillige. Cellene prolifererte og differensierte til flerkjernede og lange muskelfibre, kalt myotuber. I den siste delen av differensieringsperioden ble myotubene tilsatt CDN1163, som er en allosterisk aktivator av SERCA (figur 1). Videre i arbeidet undersøkte vi SLNs rolle i skjelettmuskelmetabolisme ved å transfektere cellene med shRNA (short hairpin RNA) som reduserte SLN-nivået i cellene. For å kunne studere de molekylære mekanismene som ligger bak muskels adaptasjon til fysisk aktivitet, ble cellene utsatt for en veletablert in vitro-treningsmodell, elektrisk pulsstimulering. Ved denne metoden tilføres cellene kronisk, lavfrekvent elektrisk puls. Energimetabolismen ble deretter undersøkt i myotubene ved å benytte radiomerkede substrater som [¹⁴C]oljesyre og [¹⁴C]glukose. Regulering av gener ble studert ved hjelp av qPCR og RNA-sekvensering, mens proteomikkanalyse og Western blotting ble utført for å kunne undersøke endringer i proteiner.
 

Resultater

Både akutt (4 timer) og kronisk (5 dager) behandling av humane skjelettmuskelceller med den SERCA-aktiverende substansen CDN1163 førte til økt cellulært opptak og oksidasjon av glukose (6). Videre ble det observert et økt opptak av fettsyre i cellene, økt mitokondriell betaoksidasjon og redusert fettakkumulering i myotuber forbehandlet med CDN1163 i 5 dager. Det ble i tillegg funnet økt aktivering av en energisensor i cellene, adenosin 5’-monofosfataktivert proteinkinase (AMPK), etter forbehandling med CDN1163.

Celler med knockdown av SLN, proteinet som anses å være hovedregulator av SERCA, viste derimot å ha sterkt redusert evne til å oksidere glukose og fettsyre fullstendig, samtidig som cellene hadde økt fettakkumulering sammenliknet med kontrollceller (7). En nedgang i mitokondriell betaoksidasjon og basalt oksygenforbruk (målt med respirometri) ble også observert i SLN-reduserte celler, noe som tyder på redusert mitokondrie funksjon i disse cellene.

Vi ønsket også å undersøke effekter av trening in vitro på energimetabolismen i skjelettmuskelceller. Det ble funnet at celler utsatt for elektrisk puls-stimulering (EPS) hadde høyere glukose- og fettsyreoksidasjon sammenliknet med celler uten EPS-behandling (8). Siden AMPK er et viktig enzym som reguleres ved trening, ble aktivering av AMPK, målt som økt fosforylering, undersøkt etter EPS. Dataene viste en økt AMPK-aktivitet som følge av EPS-behandlingen. Disse effektene etterliknet dermed endringer som normalt ses ved trening in vivo. For å kunne avdekke molekylære mekanismer identifiserte vi en rekke gener, cellulære proteiner og myokiner som ble endret i muskelcellene etter EPS-behandling, ved hjelp av dypsekvenserings- og proteomikkanalyse. Blant disse signifikant regulerte genene var det et myokin, leukemia inhibitory factor (LIF), som viste å øke glukoseopptaket i muskelcellene. Dette tyder på at en autokrin mekanisme kan være involvert i å opprettholde den metabolske homeostasen i cellene. Resultatene pekte også på økt oksidativ fosforylering, autofagi (selvspising), mitofagi (nedbrytning av mitokondrier via autofagi), samt positiv regulering av fettsyreoksidasjon og glykolyse som mulige signalveier for økt oksidativ metabolisme etter trening in vitro.
 

Diskusjon

Livsstilsendring med økt fysisk aktivitetsnivå er viktig for forebygging og behandling av fedme og type 2-diabetes. Det kan også være hensiktsmessig å anvende farmakologisk behandling for å redusere fremtidig risiko for sykdom, særlig i tilfeller hvor trening er vanskelig å gjennomføre. Et mulig angrepspunkt for legemidler mot overvekt/fedme kan være å manipulere SERCA-pumpen som bruker mye av energien som produseres i skjelettmuskel og dermed øke energiforbruket. Det er vist at svekket SERCA-aktivitet kan øke risikoen for utvikling av sykdommer som hjertesvikt, diabetes og nevrodegenerative sykdommer, mens gjenoppretting av SERCA-aktivitet representerer en mulig sykdomsforebyggende strategi (9).

I dette doktorgradsarbeidet viste vi at den SERCA-aktiverende substansen, CDN1163, økte glukose- og fettsyremetabolismen og forbedret mitokondriell funksjon i skjelettmuskelceller. Tilstedeværelsen av proteinet SLN i skjelettmuskel er også vist å øke termogenese ved å forsterke SERCA-pumpeaktiviteten (4). Interessant nok kan moderat- og høy-intensitetstrening også øke SERCA-aktiviteten (10). Vi har i dette arbeidet vist at skjelettmuskelceller som ble utsatt for EPS, har høyere oksidativ kapasitet og økt aktivering av AMPK, på samme måte som observert hos CDN1163-behandlede celler. Oksidasjon av glukose og fettsyre var derimot hemmet i celler som hadde redusert uttrykk av SLN. Samtidig ble det funnet en markant økning i fettakkumulering og redusert mitokondriell respirasjon i SLN-knockdownceller. Dette tyder på at SLN en viktig komponent som kan regulere oksidativ kapasitet, noe som er kjent å være svekket hos individer med type 2-diabetes og fedme.
 

Konklusjon

Funnene våre underbygde teorien om at farmakologisk aktivering eller genetisk manipulering av SERCA-pumpen kan ha metabolske effekter som er gunstig ved tilstander som fedme og type 2-diabetes. Resultater fra dette arbeidet har også bidratt til økt kunnskap om treningsinduserte signalmolekyler og deres mulige metabolske effekter. Dette vil kunne avdekke potensielle nye angrepspunkter for legemidler ved behandling av fedme og type 2-diabetes.
 

Referanser

1. Folkehelseinstituttet. Overvekt og fedme i Noreg. www.fhi.no/nettpub/hin/ikke-smittsomme/overvekt-og-fedme/ (Lest 1. juli 2022).
2. Ehrenborg E, Krook A. Regulation of skeletal muscle physiology and metabolism by peroxisome proliferator-activated receptor delta. Pharmacol Rev 2009; 61: 373–93.
3. Calderón JC, Bolaños P, Caputo C. The excitation-contraction coupling mechanism in skeletal muscle. Biophys Rev 2014; 6: 133–60.
4. Periasamy M, Herrera JL, Reis FCG. Skeletal Muscle Thermogenesis and Its Role in Whole Body Energy Metabolism. Diabetes Metab J 2017; 41: 327–36.
5. Pedersen BK, Saltin B. Exercise as medicine – evidence for prescribing exercise as therapy in 26 different chronic diseases. Scand J Med Sci Sports 2015; 25: 1–72.
6. Mengeste AM et al. The small molecule SERCA activator CDN1163 increases energy metabolism in human skeletal muscle cells. Curr Res Pharmacol Drug Discov 2021; 2: 100060.
7. Mengeste AM et al. Knockdown of sarcolipin (SLN) impairs substrate utilization in human skeletal muscle cells. Mol Biol Rep 2022; 49: 6005–17.
8. Mengeste AM et al. Insight Into the Metabolic Adaptations of Electrically Pulse-Stimulated Human Myotubes Using Global Analysis of the Transcriptome and Proteome. Front Physiol 2022; 13: 928195.
9. Hovnanian A. SERCA pumps and human diseases. Subcell Biochem 2007; 45: 337–63.
10. Kubo H et al. Differential effects of exercise training on skeletal muscle SERCA gene expression. Med Sci Sports Exerc 2003; 35: 27–31.

(Publisert i NFT nr. 9/2022 side 32–33)