Strukturelle og immunmodulerende egenskaper hos β-glukaner fra matsopp

Bakgrunn og hensikt

En av hovedkomponentene i soppcelleveggen er β-glukaner; polysakkarider bestående utelukkende av glukose, bundet sammen med enten (1–>3)- eller (1–>6)-β-glykosidbindinger (1). β-glukaner finnes i celleveggen både hos mikrosopp slik som encellet gjærsopp, og hos makrosopp inkludert matsopp. Mange studier har vist at β-glukaner fra sopp har evnen til å aktivere ulike immunceller, blant annet som følge av aktivering av mønstergjenkjennende reseptorer som Toll-liknende reseptorer (TLR) og dektin-1 (2). Variasjoner i struktur og fysiokjemiske egenskaper har likevel vært til hinder for en entydig oppklaring av sammenhengen mellom β-glukanenes struktur og deres aktivitet. Materialet har dessuten ofte begrenset løselighet i vann, noe som gjør strukturoppklaring utfordrende, i tillegg til at det kan være til hinder for aktivitetsstudier. Målet med dette prosjektet var derfor å gjøre strukturoppklaring og aktivitetsstudier av β-glukaner fra sopp, med utgangspunkt i matsopp som kan dyrkes og som dermed er lett tilgjengelig. I tillegg var målet med prosjektet å utvikle metoder for å finfordele vannuløselig β-glukanmateriale for å enklere kunne studere deres egenskaper.



 

Materiale og metode

Kongeøsterssopp (Pleurotus eryngii, figur 1) ble kjøpt inn fra www.trondersopp.no. Frysetørkede og pulveriserte fruktlegemer ble ekstrahert i flere runder med løsemiddel av økende polaritet: diklormetan, etanol og vann, etterfulgt av alkaliekstraksjon med 0,1 M, 0,5 M og 1,0 M NaOH. Vannekstraktet ble videre separert ved hjelp av ionebytterkromatografi. Vann- og alkaliekstrakter ble deretter karakterisert ved hjelp av gasskromatografi, massespektrometri og kjernemagnetisk resonans (NMR)-spektroskopi.

Metoder for finfordeling av lite vannløselig β-glukan ble testet på et β-glukanrikt ekstrakt fra soppen Albatrellus ovinus (fåresopp) som var blitt isolert tidligere (3). Metodene inkluderte mekanisk nedbrytning av materialet ved hjelp av enten kulemølle eller Ultra-Turrax^®, og felling av β-glukan fra alkalisk løsning. De fremstilte partikulære prøvene ble analysert, og metodenes suksess ble vurdert ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS) og skanningelektronmikroskopi (SEM).

De ulike β-glukanprøvenes biologiske aktivitet ble vurdert ved hjelp av en reportercellelinje som uttrykker humant dektin-1a, og i enkelte tilfeller reportercellelinjer som uttrykker TLR2 eller TLR2 i kombinasjon med TLR6. Prøvene ble også testet i forsøk som kombinerte stimulering av immuncellelinjer fra mus (D2SC/1) eller menneske (THP-1) med kvantifisering av frigjort nitrogenoksid (NO) og ulike proinflammatoriske cytokiner.
 

Resultater

Strukturell analyse av vann- og alkaliekstrakter viste at P. eryngii inneholder flere ulike β-glukaner med ulik struktur og fysiokjemiske egenskaper (4, 5). β-glukanene ble funnet både i vannekstraktet og alkaliekstraktene: et (1–>3)-bundet β-D-glukan med forgreninger i O-6 og et (1–>6)-bundet β-D-glukan med forgreninger i O-3. I tillegg ble det funnet et vannløselig delvis 3-O metylert (1–>6)-bundet α-D-galaktan forgrenet i O-2 med β-D-mannose, og et lite vannløselig (1–>3)-α-D-glukan.

Mekanisk nedbrytning av β-glukanprøver resulterte i redusert partikkelstørrelse, men var svært tidkrevende og medførte stor belastning på instrumentene (6). Felling av β-glukan fra alkalisk løsning var en raskere og enklere metode, og resulterte i partikler av ønsket størrelse (0,3–3 µm diameter). SEM-analyser viste at partiklene hadde svært varierende morfologi.

Alle β-glukanprøvene, fra både P. eryngii og A. ovinus, viste evne til å aktivere humant dektin-1a i reportercellelinjen. Aktiviteten korrelerte med mengden β-glukan i hver prøve. Vannløselige β-glukaner fra P. eryngii viste noe tegn til proinflammatorisk aktivitet i dendrittiske celler fra mus (D2SC/1) da stimulering førte til frigjøring av moderate mengder NO og proinflammatoriske cytokiner. De alkalieløselige β-glukanene fra P. eryngii viste ingen tegn til proinflammatorisk aktivitet i humane makrofagliknende celler.
 

Diskusjon

β-glukanene som ble funnet i P. eryngii, hadde strukturelle likheter med β-glukaner fra andre typer sopp, spesielt annen makrosopp og matsopp. Disse forbindelsene var ofte til stede i samme prøve, og isolering av de individuelle glukanene ble ikke oppnådd. Fellingsmetoden som ble utviklet, viste seg å være enkel og rask, og den krever ikke spesielle instrumenter eller utstyr. Den ble derfor ansett som velegnet for tilberedelse av finfordelte β-glukanprøver, for eksempel før videre bruk i celleforsøk. Videreutvikling av metoden bør være mulig. Spesielt vil det være interessant å undersøke hvordan partiklenes morfologi kan kontrolleres i større grad. Til tross for interaksjoner med dektin-1a-reseptoren ble det ikke funnet store indikasjoner på at β-glukanene fra P. eryngii har signifikante immunmodulerende egenskaper. De vannløselige β-glukanene viste lite til moderat aktivitet i dendrittiske celler fra mus, mens de alkalieløselige β-glukanene var inaktive i humane makrofagliknende celler. Forsøksmodellene som ble benyttet i denne studien, var likevel begrenset, og ytterligere forsøk vil være interessant for å bekrefte disse funnene. Observasjonene gir likevel en indikasjon på mulige bruksområder i situasjoner der targeting av immunceller er ønskelig uten at man setter i gang en immunreaksjon.
 

Konklusjon

β-glukaner fra matsopp er en gruppe polysakkarider med potensial for anvendelser til immunmodulerende formål. Kongeøsterssopp inneholder forgrenede (1–>3)- og (1–>6)-β-D-glukaner, i tillegg til (1–>3)-α-D-glukan og et delvis metylert mannogalaktan. Disse polysakkaridene ser ikke ut til å ha spesielt kraftige immunmodulerende egenskaper, men β-glukanene ble vist å kunne aktivere den humane dektin-1a-reseptoren. Den utviklede fellingsmetoden viste seg å være praktisk for tilberedelse av finfordelte β-glukanprøver til bruk i celleforsøk. Resultatene fra denne avhandlingen understreker viktigheten av å gjøre grundig strukturoppklaring, og hvordan dette er en nødvendighet dersom man skal kunne konkludere om hvordan den biologiske aktiviteten til β-glukaner fra sopp påvirkes av deres strukturelle og fysiokjemiske egenskaper.
 

Referanser

1. Bowman SM, Free SJ. The structure and synthesis of the fungal cell wall. Bioessays 2006; 28: 799–808.
2. Han B, Baruah K, Cox E et al. Structure-functional activity relationship of β-glucans from the perspective of immunomodulation: A mini-review. Front Immunol 2020; 11: 658.
3. Samuelsen ABC, Rise F, Wilkins AL et al. The edible mushroom Albatrellus ovinus contains a α-L-fuco-α-D-galactan, α-D-glucan, a branched (1–>6)-β-G-glucan and a branched (1–>3)-β-D-glucan. Carbohydr Res 2019; 471: 28–38.
4. Ellefsen CF, Wold CW, Wilkins AL et al. Water-soluble polysaccharides from Pleurotus eryngii fruiting bodies, their activity and affinity for Toll-like receptor 2 and dectin-1. Carbohydr Polym 2021; 264: 117991.
5. Ellefsen CF, Lindstad L, Klau LJ et al. Investigation of the structural and immunomodulatory properties of alkali-soluble β-glucans from Pleurotus eryngii fruiting bodies. Carbohydr Polym 2023; 322: 121367.
6. Ellefsen CF, Struzek AM, Scherließ R et al. Preparation of Albatrellus ovinus β-glucan microparticles with dectin-1a binding properties. ACS Appl Bio Mater 2023; 6: 1863–72.

(Publisert i NFT nr. 2/2024, side 38–39)